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拟南芥激活标签突变体筛选

赵佳  
【摘要】:目前,我国乃至世界上有很多地区的土壤盐碱化程度较高,并且呈上升趋势。在这些地区,土壤中的高盐作为非生物胁迫因子严重影响着植物的生长,同时极大地限制了该区域农作物的产量和分布,因此,提高植物特别是农作物的抗逆能力尤为重要。先前的研究表明,植物的胁迫反应是一个相当复杂的过程,且不同植物对于胁迫的反应存在一定差异。鉴于模式植物拟南芥具有基因组小、生长周期短、自花闭花授粉、易于遗传转化、便于栽培等特点,同时,它又是甜土植物,虽然不抗盐,但是相关研究表明它的基因组中含有很多与耐盐相关的基因,特别适于遗传学研究。因此,本实验以拟南芥激活标签突变体库为材料,对耐盐及耐低钾突变体进行了筛选,以期获得拟南芥耐逆机制的更多信息。 本实验首先运用分别含有70 mM NaCl、200 mM NaCl、50μM K~+/50 mM NaCl、50μM K~+/150 mM NaCl的四种MS培养基对三个拟南芥激活标签突变体库进行了表型筛选,随后以筛选出的短根突变体sr为材料,进行了突变基因的克隆,结果如下: 1.筛选得到一株低盐敏感突变体lss。当把株系1684与Col 0转移至70mM NaCl MS培养基上时,1684的部分植株(lss)出现了根生长停止、子叶卷曲萎黄等低盐敏感现象,敏感植株与普通植株的比例约为1:1,而Col 0全部生长正常。随后,将盐敏感植株的T2代幼苗转移至70 mM NaCl的MS培养基上时,部分植株(T2代lss)也出现了根生长停止、子叶卷曲萎黄等低盐敏感现象,敏感植株与普通植株的比例也接近1:1,两代的分离比都不符合孟德尔定律,仍需要进一步回交验证。 2.筛选得到短根突变体sr与mr。筛选中意外发现株系1082的T1代植株在基本培养基上生长10天左右时,根长出现了三种表型的分离:第一种(sr)根明显短于Ws;第二种(mr)短于Ws,但是长于sr,介于两者之间;第三种与Ws相似,三种表型的数量比接近1:1:1。将sr、mr、Ws一同移入土壤培养50天左右时,通过统计分析其他表型如株高、根长、叶片数、叶片大小、果荚数等发现,sr植株最矮小、根长最短、叶片和果荚数最少,Ws植株最高大、根长最长、叶片果荚数最多,突变体mr除基部叶片数多于Ws外,其余统计值仍处于两者之间。随后,将短根的sr移入土壤单株收取了T2代种子,以相同方式播种于MS培养基培养10天左右,发现sr的T2代植株全部表现短根,表型没有发生分离。 3.以筛选得到的短根突变体sr为材料,进行了突变基因的克隆。实验中首先对短根突变体T-DNA的绿色荧光蛋白基因GFP进行了PCR扩增,得到约300-400bp目的条带,从而验证了两株突变体的T-DNA都没有丢失;通过TAIL-PCR方法对短根突变体T-DNA插入位点附近的侧翼序列进行了分离,经过三轮扩增反应后,两株突变体都出现了目的条带,长度约为1500bp;通过GeneClean法回收纯化扩增片段后,连接入含有氨苄抗性的pMD18-T载体中,对大肠杆菌进行了转化;通过氨苄霉素筛选后,提取质粒并进行了酶切验证,在约1500bp处出现了目的条带;送测序公司测序发现,该条带为载体序列,没有得到侧翼序列。同时,实验中尝试运用了质粒拯救法获得侧翼序列,可能由于质粒拯救法对于DNA质量要求较高,通过此方法也没有得到目的片段。 由于TAIL-PCR与质粒拯救法都存在一定的不稳定性,并且需要一定的经验积累,对于侧翼序列的扩增条件仍需要进一步探索和分析,因此相关工作仍在进行。


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