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双孢蘑菇栽培基质中放线菌的分离鉴定及特性研究

李路军  
【摘要】:在农业生产中每年产生大量的作物秸秆,由于其主要成分—纤维素分子结构稳定及存在状态的特殊性,难以得到有效利用。近年来迅速发展的食用菌产业对农作物秸秆的利用发挥了重要作用,可用来生产双孢蘑菇、鸡腿菇、大球盖菇等多种食用菌。双孢蘑菇是能利用秸秆的草腐型食用菌之一,在经过堆积发酵的栽培基质上产生子实体,子实体产量及品质与堆积发酵程度相关。本论文在经过一次堆积发酵的双孢蘑菇栽培基质中筛选到3株放线菌LLJ-03、LLJ-04、LLJ-05,根据培养特征、16S rDNA序列及生理生化特征分别鉴定为Streptomyces griseorubens LLJ-03、Streptomyces fungicidicus LLJ-04、Nocardioides thermolilacinusLLJ-05。 S. griseorubens LLJ-03在麦草等秸秆类基质上生长良好,可以加速其生物转化。采用DNS法测定了发酵过程中羧甲基纤维素酶活力的变化:(1)在液体发酵过程中,酶活力在70U/ml至100U/ml区间呈波形变化,表明此酶活力较为稳定。在第24h酶活力为83.9 U/ml,第48h升高至85.3U/ml,在第72h又降低至73.0U/ml,之后于第120h升至96.4U/ml,然后小幅下降,于第192h升高至96.8U/ml后,再次下降;(2)在固体发酵过程中,第120h左右羧甲基纤维素酶活力达最高值484.7 U/ml。在液体发酵过程中,第24h时还原糖含量为5.12mg/ml,第48h时为5.17 mg/ml,于第72h稍微降低至4.71 mg/ml后持续增加,随着时间延长增加速率降低,还原糖总量趋于稳定,总体稳定在7.00 mg/ml左右。 S. fungicidicus LLJ-04和N. thermolilacinus LLJ-05对供试的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucum erinum)、赤霉病菌(Fusarium graminearum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveurn)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、链孢霉(Neurospora crassa)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)7种病原真菌均具有不同程度的拮抗作用。通过平板对峙试验、菌种块抑制菌丝生长试验、菌丝有机溶剂提取液抑制链孢霉生长试验、菌丝有机溶剂提取液抑制孢子萌发试验表明:(1)链霉菌菌体在生长过程中产生了一些抗真菌物质,这些物质对不同病原真菌生长的抑制程度不同,对供试食用菌的抑制作用甚微;(2)所产生的抗病原真菌物质主要存在于菌丝体内,使用甲醇等极性较大的有机溶剂提取得率较高;(3)菌丝有机溶剂提取液中的抗菌物质能够抑制链孢霉菌丝生长和供试病原真菌孢子萌发,对不同真菌孢子的抑制作用不同。 通过发酵动力学试验,S. fungicidicus LLJ-04和N. thermolilacinus LLJ-05在发酵240h以后对病原真菌的抑制率达到峰值,其产生抗菌物质的速率不同,S. fungicidicus LLJ-04菌丝成熟后分泌抗菌物质的速率快,7天就可达到峰值,N. thermolilacinus LLJ-05则需要11天左右。S. fungicidicus LLJ-04和N. thermolilacinus LLJ-05产生的抗菌物质较为稳定,抑制率随时间变化无几。通过正交试验对影响发酵条件的温度、摇床转速、装液量进行优化:S. fungicidicus LLJ-04的最优发酵条件为温度30℃,摇床转速160rpm,装液量为100ml;N. thermolilacinus LLJ-05的最优发酵条件则为温度30℃,摇床转速180rpm,装液量为75ml。 S. fungicidicus LLJ-04和N. thermolilacinus LLJ-05所产抗真菌物质在40℃以下具有热稳定性,但处理时间不宜过长;此物质耐碱不耐酸,在近中性环境中最为稳定。将此物质在用不同pH值缓冲液处理过的滤纸上展层后进行生物显影,发现不同pH下的移动距离相近,表明该产物可能为中性抗生素;经Doskochilova溶剂系统层析后,S. fungicidicus LLJ-04提取液在Ⅱ、Ⅴ两个溶剂系统中的Rf值较大,N. thermolilacinus LLJ-05提取液在Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ三个溶剂系统中具有较大的Rf值。进行紫外光谱分析发现,S. fungicidicus LLJ-04提取液在253nm、338nm处具有2个吸收峰,处于紫外吸收区;N. thermolilacinus LLJ-05提取液在407nm处存在1个吸收峰,处于可见光区。尚需进一步分离纯化后进行鉴定。


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