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发酵生产L-精氨酸的微生物育种研究

伊廷存  
【摘要】:当前,中国已成为氨基酸生产大国,如谷氨酸、赖氨酸等的产量已跃居世界领先行列。但一些小品种氨基酸如精氨酸、丝氨酸、组氨酸和色氨酸发展仍不容乐观,远远落后于发达国家,是氨基酸工业发展的“瓶颈”。而目前国内L-精氨酸的生产多采用水解法,但其提取率低、造价高、品质较差。国内生物发酵法生产L-精氨酸仍未实现自主化生产,作为生物发酵法生产L-精氨酸的前提精氨酸高产菌株,菌株的产L-精氨酸的量与发达国家如日本等还存在一定差距。针对上述现状,本文采用代谢控制发酵原理,系统的研究了L-精氨酸生产菌的选育和摇瓶发酵条件等。主要研究内容和结果如下: 1.本实验采用谷氨酸棒杆菌CICC 20191 ( Corynebacterium glutamicum CICC20191)为出发菌株(产酸量为0.2 g/L),经紫外线(UV)、微波、亚硝基胍(NTG)等物理、化学诱变剂诱变处理,经反复诱变筛选,选育出一株具有多重结构类似物D-精氨酸(D-Arg)、磺胺胍(SG)、精氨酸甲基酯(AE)等抗性的突变菌株DHR087,产L-精氨酸量为2.42 g/L。并对突变株进行了生物学特性和发酵产酸条件的初步研究,优化后L-精氨酸产量提高到4.24 g/L。 2.种子培养基正交优化:在单因素实验的基础上,对影响种子生长的关键成份—葡萄糖、硫酸铵和玉米浆进行正交实验设计,最终确定了菌株DHR087合成L-精氨酸的最佳种子培养基组成(g/L):葡萄糖30 g/L,硫酸铵25 g/L,玉米浆25 g/L,磷酸二氢钾1 g/L,硫酸镁0.5 g/L,碳酸钙10 g/L。种子最佳培养条件:初始pH 7.0,装液量为25ml/250ml。 3.发酵培养基和条件优化:首先研究了影响突变菌株DHR087产L-精氨酸的因素:葡萄糖、硫酸铵、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、生物素、碳酸钙,通过分别改变上述几个因素的量,探索了各因素对产酸的效应,并确定了影响产酸的主要因素:葡萄糖、硫酸铵和玉米浆。采用minitab软件中的Box-Behnken Design建立了响应曲面模型,经过优化确定了最佳发酵培养基:葡萄糖112.73 g/L,硫酸铵35.76 g/L,玉米浆25.15 g/L,磷酸二氢钾1.5 g/L,硫酸镁0.5 g/L,碳酸钙30g/L。并确定了相应的最佳发酵条件:温度30℃,初始pH 7.0,装液量30ml/250mL,种龄16h,接种量8%。


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