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牛源金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因分析及抗生素对其影响

李丽  
【摘要】:金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌,在乳腺中主要以生物被膜的形式存在。研究金黄色葡萄球菌生物被膜的形成能力和相关效应因子,对于我们在临床治疗中筛选针对生物被膜的药物和研究抑制生物被膜形成的抗原表位疫苗具有十分重要的意义。本实验针对金黄色葡萄球菌生物被膜进行如下研究: 1.奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成及相关基因分析 利用硅胶片法培养葡萄球菌生物被膜,经充分洗涤后对生物被膜进行银染定性判断菌株形成生物被膜的能力,通过生物被膜菌落结晶紫染色法定量检测菌株生物被膜的形成能力,并用扫描电镜观察被膜结构。银染法定性结果显示137株葡萄球菌中有120株形成肉眼可见的生物被膜,生物被膜形成率为87.6%;结晶紫染色定量检测与硅胶粘附的有132株,不粘附的有5株。对葡萄球菌bap、icaAD、icaBC、sar、agr、sigB、clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB基因进行PCR扩增检测。实验所用的137株葡萄球菌中,57株能扩增出bap基因;有43株和54株分别能扩增出icaAD和icaBC;有73株、49株和38株分别扩增出sigB、sar和agr;分别有76株和50株染色体中存在clfaA和clfaB;fnbpA和fnbpB分别在52株和26株菌株中扩增出。推测bap、sigB、sar、icaAD和icaBC基因是生物被膜形成的重要相关基因;agr及粘附素基因clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB对生物被膜形成的作用不明显。 2.抗生素对生物被膜的影响 采用硅胶片24孔板法培养e9和e25株生物被膜,初始培养时每孔分别加入1ml含有1/16MIC抗生素的TSB,每12小时用含抗生素的TSB换液,37℃连续培养3天,采用结晶紫染色,测定492nm处的光密度值。发现对于生物被膜强株e9,头孢吡肟有明显的抑制作用,Amp、Met对生物被膜的形成没有抑制作用,生物被膜的形成反而增强;而对于生物弱株e25,Amp和头孢吡肟对其生物被膜的形成几乎没有抑制作用,Met有抑制作用,与空白对照组相比差异极显著。 分别取实验菌株培养3天和7天的生物被膜,放入含各种抗生素的TSB的24孔板37℃培养1天,每12小时用含抗生素的TSB换液,结晶紫染色后测492nm的OD值。对于生物被膜强株e9,除了低浓度(1/16MIC)的头孢吡肟,其他浓度的抗生素都对其3天生物被膜有抑制作用,10倍MIC的Amp和头孢吡肟抑制效果显著(P0.05)。除了MIC浓度的Amp,其他浓度的抗生素都对7天成熟生物被膜有抑制作用,抗生素浓度越大作用越明显。对于生物被膜弱株e25,1/16MIC的Amp对3天生物被膜几乎没有抑制作用,其他浓度的抗生素都有抑制作用,但不显著。而MIC的Amp对7天生物被膜有很微弱的抑制作用,10倍和20倍MIC抗生素浓度有抑制作用;三种浓度的Met和头孢吡肟对7天生物被膜都有抑制作用, 20倍MIC的Met和头孢吡肟与对照组相比差异极显著(P0.01)。结果表明:高浓度比低浓度的Amp、Met、头孢吡肟对生物被膜有较好的抑制作用,相同浓度的抗生素对未成熟生物被膜有较好的抑制作用。低浓度的Amp、Met对生物被膜几乎没有抑制作用,反而有利于刺激促进生物被膜的形成,生物被膜形成能力越强的菌株,这种促进作用越明显。 3.构建奶牛乳腺T7噬菌体展示cDNA文库 使用Straight A’sTM mRNA Isolation System的Magnetight Oligo(dT) Particles分离纯化奶牛乳腺mRNA,反转录合成双链cDNA。双链cDNA经过末端修饰后连接上定向EcoR I/Hind III接头,经Hind III和EcoR I消化,Mini Column分级,除去300bp以下的cDNA片段和多余的接头。将插入片段与T7Select10-3b载体臂连接,经体外包装后,感染BLT5403宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。经稀释铺平板测定原始文库含6×10~5个克隆。


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