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桔梗皂苷的抗氧化及脂质调节作用研究

吴敬涛  
【摘要】:机体脂质异常是本世纪常见又多发的症状,常引发动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病。动脉粥样硬化是由于体内过大的氧化压力造成的慢性炎症反应,氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)会加速动脉硬化病变,其原因可能是直接对内皮细胞一氧化氮(NO)合成的细胞毒活性、内皮细胞通过选择性的表达细胞表面粘附分子如动脉细胞粘附分子和细胞粘附分子而结合单核细胞使其转化,及平滑肌细胞的增殖与迁移等。临床常用药物以西药为主,副作用较大,所以寻求与开发降血脂与抗动脉硬化的天然药物以及抑制低密度脂蛋白氧化和损伤的天然药物的研究非常必要。 桔梗Platycodon grandiflorum A. DC.,为桔梗科(Campanulaceae)桔梗属(Platycodon)植物,是中国及其他亚洲国家重要的药食两用资源,广泛用于食品及治疗很多慢性炎症,如支气管炎、哮喘及肺结核等。化学分析结果显示三萜皂苷为其主要活性成分。早期的研究揭示了诸多三萜皂苷的提取与结构分析,如桔梗皂苷A、C、D等为桔梗三萜皂苷的重要活性成分。桔梗皂苷被发现具有很多的生物学活性,如免疫调节作用、抗炎作用、神经保护作用、诱导角质细胞凋亡、镇痛作用、抗白血病作用和抗癌作用等。特别是其调脂方面的研究,提示桔梗可能具有抗氧化损伤或对动脉粥样硬化的干预作用。 本课题以鲁山地区采集的桔梗为材料,研究其主要活性成分桔梗总皂苷(PGTS)与桔梗皂苷D(PD)的提取与鉴定、体外抗氧化作用,如清除自由基及还原力的研究;PGTS对高脂乳剂诱导的大鼠血清及肝脏脂质水平的影响,如总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白AI(ApoAI)、载脂蛋白B(ApoB)、动脉硬化指数TC/HDL-C和AI等;对体内氧化状态的影响,如对血清和肝总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的作用;对与胆固醇代谢相关的低密度脂蛋白受体(LDL-r)蛋白表达、3-羟基-3-甲基-辅酶A还原酶(HMG-CoM-r)蛋白表达、胆固醇7α-羟化酶1(CYP7A1)基因表达的影响及对粪便中胆汁酸含量的影响等;同时分离PD,研究其对OxLDL诱导的内皮细胞的MDA、NO分泌、动脉细胞粘附分子(VCAM-1)和细胞粘附分子(ICAM-1)表达、单核(THP-l)-内皮细胞(HUVEC-12)粘附状态的影响等。从而确定桔梗总皂苷的抗氧化及脂质调节作用的机理。 实验选用大孔吸附树脂作为提取桔梗总皂苷的材料,与超声波辅助水提方法进行对比,优化实验条件,建立制备桔梗总皂苷的方法。在此基础上利用硅胶柱,进一步对桔梗总皂苷进行分离,充分利用不同部位极性的差别,获得PD。 结合文献资料,配制高效高脂乳剂,刺激SD大鼠,2周建立高脂乳剂大鼠模型,分别以低(30mg/kg B.W. /d)、中(50mg/ kg B.W. /d)、高(100mg/ kg B.W. /d)三个浓度桔梗总皂苷和25mg/ kg B.W. /d辛伐他汀阳性药物灌胃处理,连续4周后。禁食过夜(12h),取血清测其TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAI、ApoB、T-AOC、SOD、MDA值;取肝脏制匀浆测其TC、TG、T-AOC、SOD、MDA值;取肝脏组织做组织冰冻切片,油红-O染色,观察脂质化状态及氧化损伤;免疫组化法检测肝脏LDL-r蛋白表达;免疫印迹法检测肝胆固醇合成限速酶HMG-CoM-r蛋白的表达;聚合酶链式反应(PCR)技术检测胆固醇代谢酶CYP7A1基因的表达;同时采集大鼠粪便,化学法检测粪便中胆汁酸的水平。 利用OxLDL诱导人脐静脉内皮细胞,建立其氧化模型,分别以0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.25 mg/mL PD处理后,测定培养液NO和MDA水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)研究细胞内动脉细胞粘附分子和细胞粘附分子的表达;同时进行单核细胞与内皮细胞的粘附实验,以期探讨PD对氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞的氧化损伤的影响。 研究结果表明,PGTS和PD具有较强地体外清除自由基的能力,具有较强的还原力,且呈浓度依赖关系,可作为抗氧化剂使用。同时发现,三个不同剂量桔梗总皂苷不同程度地降低了饲喂高脂乳剂诱导的大鼠血清与肝脏高脂质水平和氧化状态;显著升高大鼠肝脏LDL-r蛋白表达,降低了肝脏HMG-CoM还原酶合成,增强了肝脏CYP7A1基因表达,同时使粪便中的胆汁酸的排出量也显著增大。 PD对内皮细胞的干预结果表明,PD能显著的降低内皮细胞由氧化型低密度脂蛋白诱导的NO合成和MDA浓度;显著地降低动脉细胞粘附分子和细胞粘附分的表达水平;显著地抑制单核细胞与内皮细胞的粘附作用。 基于上述结果可以得出,PGTS具有较强的抗氧化能力,降低了大鼠体内氧化状态,减少了氧化损伤的机率,而PD的抗动脉粥样硬化活性至少部分地是因为其增加NO浓度,降低OxLDL诱导的内皮细胞粘附分子表达和减少内皮细胞与单核细胞的粘附作用。 桔梗总皂苷的体内外抗氧化作用与脂质调节作用说明其降低脂质水平的作用,特别是其对胆固醇水平的调节,是因为显著升高大鼠肝脏LDL-r蛋白表达,使血液胆固醇更有利于向脏细胞内的运输;同时降低了肝脏HMG-CoM-r合成,减少了游离胆固醇的合成;增强了肝脏CYP7A1基因表达,进一步增强胆固醇向胆汁酸的转化且增加了粪便中的胆汁酸的排出等。从而有效地降低了脂质氧化的机率,减少了对心血管等的损伤,起到对动脉壁等的保护作用。由此可见,桔梗应是一种新的具有替在的抗氧化、降脂和抗动脉粥样硬化作用的天然产物。


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