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青狐尾草突变体库的建立及丛生芽的遗传转化

李玮  
【摘要】:青狐尾草(Setaria viridis)是盛产于夏季的一年生草本植物,属于禾本科虎尾草属,是藜亚科的一个分支。自交用种子繁殖;是二倍体植物,染色体数为2n=36。基因组较小,约为510 MB。株型矮小、生存条件简单、生长周期短,青狐尾草的这些优点有利于C4光合的研究。青狐尾草属NADP-ME亚型C4植物,对C4植物的研究非常具有代表性。本论文叙述了将青狐尾草作为研究C4光合作用的模式植物所做的一些工作,主要包括两方面:利用理化方法构建青狐尾草突变体库及利用丛生芽探索青狐尾草的遗传转化方法。 本论文中选用青狐尾草作为诱变材料,利用两种理化方法构建突变体库,筛选与光合作用相关的突变体。分别采用0.1%、0.2%、0.3%、0.4%EMS诱变处理24小时,150、200、300Gyγ-射线诱变处理。EMS诱变获得12,000份单株收获的种子,及获得13,100份γ-射线诱变处理的M1代种子。在温室及田间种植M1、M2代突变群体并观察变异表型。试验田中,在6,700个M2分离株系中共筛选到206个形态突变体,突变频率为3.07%,其中EMS诱变中有形态变异的株系有158个,发生频率为2.6℅,γ-射线诱变中发生形态变异的株系有48株,发生频率为6.8℅。突变主要集中在叶片、叶脉、株高、穗型及黄化等方面,在EMS诱变M2代株系中以叶片变异的突变频率最高(1.03%),其次是叶脉变异、矮化、穗变异,其发生频率分别为0.55%、0.43%、0.41%。叶片变异主要有叶色、叶型和叶的生长位置的变异。穗的变异包括穗型及出穗位置。叶脉的变异有偏脉、二级脉明显及主脉分枝。除了这些形态突变体,我们还筛选到75株叶脉减少的突变体,发生频率为1.1%。并将叶脉减少的叶片制作石蜡切片临时装片,在显微镜下观察可知叶脉数目的减少是由于细胞体积增大造成的。 将青狐尾草作为研究C4光合作用的模式植物,转化体系还不成熟。由成熟种子胚诱导的愈伤组织再生获得植株效率较低。在本实验中,建立了离体丛生芽的再生体系并以丛生芽为转化对象进行转化。首先是丛生芽的组织培养,切取青狐尾草无菌幼苗的芽尖,放在诱导培养基上诱导青狐尾草丛生芽,其中诱导培养基是由改良后的MS培养基并添加2.0mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2,4-D组成的。得到丛生芽后在添加2.0 mg/L 6-BA的继代培养基上培养,获得足够大适于转化的丛生芽块。将丛生芽块分割成单芽,进行基因枪转化。轰击后在含有4.0 mg/L 6-BA的MS基本培养基中恢复培养一周,转移至筛选培养基上连续筛选4次,每次两周,筛选得到的小苗转入生根培养基,足够大后移入土中,并对获得的植株进行PCR鉴定,其中有8棵能够扩增出。T1代植株进行鉴定,发现部分能扩增出GUS条带。青狐尾草再生体系已成功建立,转化株系需要进一步鉴定。


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