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狗尾草突变体的初步筛选及细胞特异性表达启动子的获取

龚秀秀  
【摘要】:高等植物在光合类型上可分为C_3、C_4和CAM三大类型,C_4植物比C_3植物具有更高的光能利用效率。C_4植物有维管束鞘细胞(BSC)和叶肉细胞(MC)构成的花环结构(Kranz),叶片叶脉密集便于四碳酸和糖的交换。BSC和MC相互协作所形成的“CO_2泵”具有浓缩CO_2的机制,提高了BSC中CO_2浓度,促使BSC中的Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase(RubsiCO)发挥羧化酶的作用固定CO_2,阻止了O_2与RubsiCO结合,降低植物的光呼吸,提高了碳的固定率,增加了干物质产量。随着人口数量的增加,现有的粮食作物不能满足人类粮食需求,人们可以通过基因工程手段把C_4植物光合作用原理应用到C_3植物水稻上,以提高水稻光合作用效率,增加粮食产量。 狗尾草(Setaria viridis)属于C_4光合作用NADP-ME型亚型,狗尾草生存能力很强,具有基因组小(510Mb)、植株矮小(10–15cm)、生活周期短(约6周)、种子产量高等优点。因此,狗尾草在研究C_4光合作用上具有很大潜能,可以作为典型的C_4模式植物用于研究C_4光合作用的分子机制。 本研究主要进行了狗尾草形态突变体的初步筛选和狗尾草细胞特异性表达启动子的获取。获得一定数量的狗尾草种子后,对种子进行0.2﹪和0.4﹪EMS诱变处理24h,种植获得12,000株M1代种子;γ-射线150Gy、200Gy、300Gy诱变种子,种植获得13,000株M1代种子。共种植EMS诱变处理种子6,000株系,γ-射线诱变种子3,700株系。筛选狗尾草突变体时,筛选到形态上矮小、多分蘖、畸形、黄化、叶片失绿,在发育过程中有早育、不育、早衰等表型的植株。 由于狗尾草基因组测序还未完成,所以,在克隆狗尾草细胞特异性表达启动子时,参考同源性高的谷子序列设计引物,克隆出在玉米MC和BSC中特异性表达的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)三个C_4光合作用过程中重要基因的启动子。扩增得到目的片段之后测序,用ClustalX2.0比对,结果发现狗尾草启动子序列与谷子启动子序列存在差异。用PLACE软件分析序列,确定了TATA-box、CAAT-box基本顺式作用元件区域,转录因子DOF、光反应元件GT1的结合区域,为进一步研究启动子的细胞特异性奠定基础。 将获得的目的片段连接到表达载体pCAMBIA3301,替换驱动GUS表达的35S启动子,转入农杆菌后,浸染狗尾草愈伤组织和丛生芽。在狗尾草愈伤遗传体系中,把种子去除种皮诱导愈伤组织,而具有胚性的愈伤组织诱导率低,继代培养中愈伤的胚性容易丧失,农杆菌浸染后,愈伤易水渍化、再生能力差。同时采用了狗尾草丛生芽遗传转化体系的方法获得细胞特异性表达抗性植株,用无菌的胚尖作为外植体,在2,4-D0.5mg/L、6-BA2.0mg/L培养基上诱导产生狗尾草丛生芽,并继代培养。研究发现狗尾草丛生芽分化率高,但是狗尾草丛生芽分化能力最强的时间不容易掌握,目前仍未获得抗性转化植株,仍需在今后的实验中进一步地探讨、摸索培养条件。 本文主要创新点: 1、初步构建了狗尾草突变体库,为进一步筛选到稳定遗传的狗尾草C_4途径缺陷突变体奠定基础,为研究C_4光合作用遗传机理提供材料。 2、首次克隆了狗尾草细胞特异性启动子pPEPC、 pPPDK、pPCK,对其进行序列分析,确定了TATA-box、CAAT-box基本顺式作用元件区域,转录因子DOF、光反应元件GT1结合区域,为更一步研究启动子的细胞特异性奠定基础。将目的片段连接到表达载体上浸染狗尾草愈伤组织和狗尾草丛生芽,以期获得抗性植株,为进一步研究狗尾草细胞特异性表达启动子的作用奠定基础。


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