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狗尾草突变体的初筛及保卫细胞特异性启动子的克隆鉴定

董雯  
【摘要】:C_4光合作用是很多重要的粮食及能源作物固定碳的方式。研究发现,C_4植物的光能利用率比C_3植物高50%。将C_4光合途径引入水稻中,可以使水稻的光能利用率和产量提高50%,并且能够潜在的提高氮素和水分利用效率。 狗尾草(Setaria viridis),是典型的C_4植物,禾本科,一年生草本。狗尾草是二倍体植物,2n=36,基因组很小,约为510M;植株矮小,所需生长条件易于控制;生长周期短,其光合途径是NADP-ME途径,是一种典型的C_4光合途径。基于以上优点,狗尾草成为研究C_4光合作用的模式植物。 保卫细胞是植物叶片中水分和气体的进入通道,能够保持植物自身蒸腾作用和光合作用的平衡。经研究发现,在拟南芥保卫细胞中过量表达碳酸酐酶基因,转基因植株出现了以下变化:气孔导度下降;瞬时水分利用效率上升;CO2固定速率未发生改变;离体叶片鲜重损失较少;气孔密度和气孔指数减小。这就为我们增加了一种提高植物水分利用效率的方法。 在本论文中,主要做了以下两方面的工作: 1.筛选狗尾草突变体:采用物理和化学方法诱变狗尾草种子,观察狗尾草的突变表型,重点寻找C_4相关的突变表型。在这部分的实验中,我们采取了EMS诱变和γ射线诱变的方法,对狗尾草种子进行诱变处理,单株收取M2代种子。其中,EMS诱变处理浓度是0.4%和0.2%;γ射线诱变剂量为300、200、150Gy。收取到M2代种子后,采取田间种植的方法,筛选M2代突变体。目前为止,我们已经进行了两次大规模的筛选,共筛选了EMS诱变突变体6000份,γ射线诱变突变体3700份,已经获得了大量的突变体。其中,共筛选到了叶脉形态突变体60个,叶脉数目突变的突变体32个。叶脉形态突变主要有叶脉分支,次级脉明显,偏脉等;同时,我们将叶脉数目发生变化的植株叶片固定,制作石蜡切片,观察其叶脉的花环结构。结果显示,尽管植株叶脉数目发生了变化,它们的花环结构并没有发生明显的变化。这也说明叶脉数目变化是其他原因造成的,比如细胞体积增大。 2.克隆鉴定保卫细胞特异性表达启动子:根据Nelson在2009年所发布的水稻植株中各基因表达的基因芯片的结果,找出能够在保卫细胞中特异性表达的基因,根据基因的表达丰度等因素从中选择了几个基因分别是:Os05g47630,Os09g15720,Os10g31320,Os04g57030,Os09g15670,Os08g02210,Os08g31810,Os04g57020,根据现有的基因序列,找到各基因的调控区域,对调控区域进行分析,重点分析保卫细胞特异性基序的出现次数和位置,克隆所选基因的启动子。将克隆的启动子连接到载体pCAMBIA1301上,构建表达载体。利用农杆菌介导的转化方法将构建好的表达载体转入水稻愈伤组织中,经过抗性筛选,再生,生根几个阶段,获得了pCAMBIA1301-pOs08g31810::GUS、pCAMBIA1301-pOs08g02210:: GUS、 pCAMBIA1301-pOs04g57020::GUS、pCAMBIA1301-pOs09g15670::GUS、pCAMBIA1301-pOs10g31320::GUS的转基因植株各15、11、12、11、10棵。对转基因植株进行PCR鉴定,共得到阳性转基因植株28棵,对转基因植株进行GUS染色,没有检测到GUS基因表达。


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