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乳腺癌循环肿瘤细胞的捕获及细胞内雌激素受体的检测

王利花  
【摘要】:乳腺癌引起死亡的主要原因是癌症的转移复发。乳腺癌肿瘤细胞易进入血液循环,经过一系列复杂机制形成转移灶,循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)的检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后。乳腺癌的一个重要生物学指标是细胞内雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)水平,肿瘤细胞内雌激素受体水平可以用来判断能否采用内分泌疗法,CTCs中雌激素受体的存在状态与初始肿瘤细胞可能不同,如果初始肿瘤组织呈ER阴性的病人CTCs中ER呈阳性,病人也可能受益于内分泌疗法。 论文建立了捕获CTCs的微流控芯片法以及观测捕获细胞中ER分布情况的免疫组织化学技术。基于此种微流控芯片的捕获与检测方法,具有试剂消耗少、高通量、分析过程自动化、分析速度快、易于集成化等优点。论文主要包括三个部分,内容如下: 第一章绪论概述了CTCs的捕获与检测方法、ER检测方法、检测意义及它们与肿瘤的关系。重点综述了微流控芯片捕获检测CTCs的方法及其研究进展。 第二章建立了一种CTCs微流控芯片捕获方法。抗上皮细胞粘附分子(Epithelial celladhesion molecule,EpCAM)的抗体能够特异性识别细胞表面的EpCAM,在微流控芯片通道中修饰抗EpCAM抗体,当CTCs经过芯片通道时,可被通道内修饰的抗EpCAM抗体特异性捕获。实验对芯片表面抗体修饰条件、进样流速、进样方式等进行了优化,比较了微柱、弯道、螺旋三种芯片结构对人乳腺癌细胞(Michigan Cancer Foundation-7,MCF-7)的捕获效率。在芯片直接包被抗体、抗体孵育3h、注射泵流速为10μL/min的条件下,微柱结构的微流控芯片捕获细胞效率最高。 第三章论文采用免疫酶细胞化学技术和免疫荧光细胞化学技术分别观测微流控芯片捕获的MCF-7细胞中雌激素受体分布情况。免疫酶细胞化学技术:采用甘氨酸-盐酸缓冲溶液将微流控芯片捕获的细胞洗脱至酶标板孔内,采用抗ER抗体(anti-Estrogen Receptor,anti-ER)孵育MCF-7细胞,依次加入酶标二抗及底物显色,定性分析细胞中ER的分布情况,结果显示MCF-7细胞中含有ER,可定性判别表达量多少,但无法清楚地观测该受体在细胞内具体的表达分布。免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微镜技术原位观测芯片中捕获细胞内ER分布情况的方法:采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)标记anti-ER,合成FITC-anti-ER荧光探针。微流控芯片捕获的MCF-7细胞经多聚甲醛固定、Trion X-100透膜、牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭后,采用合成的FITC-anti-ER荧光抗体孵育细胞,待FITC-anti-ER和ER充分反应后,洗去多余的未结合荧光抗体,激光扫描共聚焦显微镜技术观测,荧光图像可清楚地显示雌激素受体主要分布在细胞核内。


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