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基于16SrRNA基因的食源性致病菌的实时荧光PCR检测研究

刘玲雪  
【摘要】:近年来食品安全事件频发使得食品安全已经成为了全民关注的共同话题。食品安全问题成为关系到各个层次的人的民生问题,而在各类食品安全事件中,由食源性致病菌引起的食物中毒是食品安全问题的主要方面。最常见的食源性致病菌有志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。目前国内对食源性致病菌的检测方法主要沿用传统的细菌分离培养鉴定法,其检测过程复杂琐碎,耗时太长,不仅灵敏度不高,且每次只能确定或排除一种病原菌,难以满足对食源性致病菌快速准确检测的需要。因此,建立一种多重、快速、高效的检测技术是十分必要的。本研究利用TaqMan探针技术建立了针对志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)这三种主要食源性致病菌的多重实时荧光PCR检测技术。利用16SrRNA基因作为靶基因设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针,引物和探针双重控制靶基因的选择,具有很好的特异性和灵敏度。研究结果:(1)选取细菌16SrRNA基因作为靶基因,设计PCR引物,以志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌三种菌为目标菌,六种菌为对照菌,通过普通PCR扩增及测序验证,该引物可以作为兼并引物用于进一步研究。(2)优化建立针对单一细菌基因检测的单一实时荧光定量PCR检测体系,在单一实时PCR检测体系的基础上进一步优化建立了三重实时荧光PCR检测体系。(3)实时荧光PCR体系特异性良好,只有目标菌株出现阳性扩增信号。(4)灵敏度高,基因组DNA灵敏度为10-4 ng。(5)成功构建质粒标准品,绘制了3株菌的标准曲线。研究结果表明,本课题建立的针对志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重实时荧光PCR方法,简便快捷,大大缩短了检测时间。在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景。


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