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中压分离松花粉多糖及高低分子量酯化多糖对巨噬细胞影响的研究

杨金鑫  
【摘要】:从马尾松花粉中提取的多糖组分具有多种生物活性,如对Hep G2的抑制作用、对脾脏中T、B淋巴细胞免疫方面的调控作用以及对平滑肌细胞Ca2+水平的调节等。本论文基于实验室之前的工作,采用新的中压制备色谱技术分离纯化出单一的多糖组分并对其进行化学修饰与分子打断,探究多糖结构对巨噬细胞免疫调节能力的影响,并分析对应的构效关系。一、对200 g破壁的马尾松花粉多糖进行热水浸提,三氯乙酸法将干扰多糖功能研究的蛋白质杂质去除,用20%、40%、60%、80%不同浓度梯度的乙醇进行分级沉淀,得到0.98 g PPM20、0.54 g PPM40、2.98 g PPM60和2.74 g PPM80四种粗多糖组分,并把PPM60和PPM80作为分离单一组分的材料。二、选用中压制备色谱技术将得到的松花粉粗多糖进行分离与纯化。先对四种分子量确定的糖标准品混合液进行分离,探索合适的中压色谱层析条件,最终确定为三蒸水洗脱流速为2.5 ml/min、上样量为1ml且浓度为80 mg/ml、柱压控制在2-4 bar、延迟6分钟收集,隔40s收集一管。根据实验需求中压分离制备粗多糖SPPM80并收集第二个峰,纯化出单一组分命名为PPM80-B,测得分子量为317.76K。用盐酸降解成小分子多糖,命名为DPPM80-B,测得分子量为3.13K。氯磺酸-吡啶法将两种多糖进行硫酸酯化,命名为SPPM80-B和SDPPM80-B,测得取代度为1.08和1.34。三、MTT法检测四种多糖组分在不同浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7相对活性的影响。结果表明,松花粉多糖对细胞的作用呈现低浓度促进、高浓度抑制的现象,浓度为400?g/ml时促增殖效果最为显著。化学基团的修饰对多糖活性的影响表现在硫酸酯化后的多糖显著增强了RAW264.7细胞的增殖能力,比未酯化多糖提高了46.2%。分子量方面,未降解的多糖对巨噬细胞的促增殖能力比降解后高24.3%。四、用四种多糖组分刺激小鼠巨噬细胞,通过对细胞黏附、迁移、吞噬及细胞因子和炎性介质的分泌合成情况等指标的检测来研究多糖在免疫调节方面的作用。同时加入多糖受体TLR4的抑制剂组,观察其在多糖影响细胞功能发挥过程中起到的作用,初步探索细胞表面受体识别多糖组分并引发信号通路的分子机制。结果显示,酯化多糖显著增强巨噬细胞的黏附、迁移与吞噬能力,诱导细胞因子IL-1、IL-6、TNF-?的分泌和炎性物质NO、NO合酶的生成,效果略差于阳性对照LPS组,未酯化的作用效果一般。分子量在黏附与吞噬方面作用差别不大,而在迁移和细胞因子的分泌上,未降解的小分子多糖生物活性优于降解后的。TAK-242处理组有效抑制了酯化多糖增强巨噬细胞免疫调节能力的作用,且抑制率在45%左右,验证了多糖组分激活巨噬细胞的过程当中有一部分是通过表面受体TLR4的识别来发挥作用的。


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