靶向线粒体内生物硫醇新型荧光探针的合成及应用研究

【摘要】：荧光染料,由于其具有穿透性强、背景干扰小、良好的生物相容性等优势,逐渐取代了放射性同位素法作为生物分析的主要工具;其广泛应用于生物分子检测、癌症早期诊断、荧光活体成像等领域,可实现生物分析过程中的可视化、低损伤检测。而花菁类染料作为一种重要的荧光染料,不仅结构样式多,而且还具有良好的选择性、波长位于近红外区域、穿透深度好以及量子产率高等优点。目前已经研究出许多以花菁类染料为荧光团的近红外荧光探针,已经广泛运用在环境分析、细胞内小分子标记、活体成像和临床检验诊断等诸多方面。生物硫醇不仅与蛋白质的合成和细胞代谢等多种生命活动过程息息相关,而且在维持细胞内正常生理功能平衡和抗氧化系统中扮演重要角色。半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)则是三种主要的生物硫醇;虽然它们在细胞中的含量水平不同,具体功能也不尽相同,但是在维持细胞内正常生理功能平衡等方面都是极其重要。众所周知,细胞的生命活动靠线粒体提供能量,线粒体对细胞内的ATP合成、细胞凋亡等各种活动都至关重要,它的功能异常通常会引起细胞内氧化还原失衡,进而导致细胞凋亡。不仅如此,线粒体内的许多生物硫醇也对细胞维持正常生理功能有着重要影响;线粒体内的Cys和GSH都是线粒体内至关重要的还原剂,它们的主要作用之一是清除由线粒体产生的活性自由基,保护细胞免受自由基氧化损坏。例如,线粒体中的Hcy主要对线粒体氧化应激敏感,它们在线粒体内含量异常时会导致肝脏损伤等多种疾病。目前已发展的检测半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽反应位点多为磺酰基、卤乙酰基、丙烯酸酯、醛基等;反应类型少,并且高组织穿透性和稳定性的近红外荧光探针依然匮乏。鉴于硫醇小分子在维持细胞正常生理活动中有重要作用,因此,在生理条件下研发对细胞内特别是线粒体内生物硫醇具有高选择性、特异性的新型反应位点和荧光探针,对于检测细胞内生物硫醇水平异常及了解其在疾病发生、发展中的作用,具有重要的研究意义。主要工作如下所述:1.本章使用5-硝基-2-呋喃酸酯作为新型靶向生物硫醇的反应位点构建了一种有机小分子荧光探针Cy-FN,探针选择半花菁为荧光材料,荧光母核中吲哚阳离子为线粒体靶向位点。在探针的合成过程中,本章使用高分辨质谱和核磁手段对最终探针和中间产物进行了详细的表征,并通过质谱检测法验证了可能的反应机理。探针不仅对Cys/Hcy和GSH具有良好的选择性,还具有较低的检测限、生理范围内的p H变化和其他氨基酸对该检测结果不产生干扰。本章还使用紫外吸收光谱和荧光光谱对探针和生物硫醇反应体系进行了光谱测试和反应条件优化,最后通过对Hep G2细胞内生物硫醇的荧光成像和线体内共定位实验,说明了本章构建的探针Cy-FN可以用于检测活细胞线粒体内生物硫醇。2.本章使用氯乙酰基作为巯基的识别位点,以花菁酮为荧光团,合成了一类具有可视化检测生物硫醇的新型近红外荧光探针Cy-CC。在探针的合成过程中,已经通过高分辨质谱和核磁手段对探针和中间产物进行了详细的表征,并通过化学体系测试发现探针Cy-CC能选择性识别生物硫醇,硫醇上巯基会特异性的进攻荧光探针Cy-CC分子内的酯键,导致分子内酯键的断裂并且荧光团由烯醇式转变为具有强荧光的酮式结构。为了探究探针能否用来检测细胞内的生物硫醇,本章进行了相应的细胞毒性分析,实验结果表明探针Cy-CC对细胞具有良好的生物相容性。