盐地碱蓬SsNHX1基因的克隆及转基因拟南芥的培育

【摘要】： 盐胁迫条件下，植物细胞渗透均衡和离子正常均衡状态被破坏，特别是胞质中过多的Na~+对植物细胞的代谢产生毒害，影响到植物细胞的调节机制。植物细胞为适应胁迫环境，具有一系列的适应机制，一方面积累可溶性物质；另一方面，尤其是盐生植物则通过Na~+外排或者Na~+区隔化和调整K~+／Na~+比率的机制来保持胞质内较低的Na~+浓度，以消除Na~+的毒害，此过程中，Na~+／H~+反向转运蛋白起到重要作用。 甜土植物拟南芥胞内控制离子区隔化基因AtNHX1及Na~+外排的基因SOS1均已克隆，并且AtNHX1在拟南芥中的过量表达显著提高了转基因植株的耐盐性，开创了降低Na~+毒害的基因操作新途径。真盐生植物盐地碱蓬基因SsNHX1对离子均衡所起的作用，通过SsNHX1基因在拟南芥中的过量表达，进行进一步的研究，对于植物细胞离子均衡研究具有重要意义。 本实验对盐地碱蓬SsNHX1基因进行了克隆(GenBank注册号AF370358)。由于Na~+／H~+反向转运蛋白基因已在拟南芥，水稻等植物中得到克隆。不同的Na~+／H~+反向转运蛋白基因具有保守区域，根据保守区段设计引物，扩增得到SsNHX1的部分片段，利用RACE方法得到其两端序列。由序列设计两端特异引物，RT-PCR扩增到SsNHX1全长cDNA，将其克隆并进行序列分析，结果与报导的其他物种中的Na~+／H~+反向转运蛋白序列具有较高的同源性。SsNHX1基因cDNA全长1665bp，编码一个分子量约61kD的蛋白。得到SsNHX1片段后，对其在碱蓬中的拷贝数及表达特性进行了分析，Southern结果表明SsNHX1在碱蓬中至少有3个拷贝，应是一个基因家族。Northern结果显示SsNHX1是受盐胁迫诱导的基因，特别是在叶中的表达更易受到盐诱导，这与其Na~+／H~+转运的功能相一致。将SsNHX1cDNA全长ORF克隆入表达载体pROK2中，导入根瘤农杆菌GV3101后，由渗透法进行拟南芥遗传转化，转基因植株经分子检测共得到23个独立转基因植株，PCR结果表明均有外源基因的插入，Southern结果进一步证明外源SsNHX1已整合到拟南芥染色体组中，并有单位点插入和多位点插入的区别。选择在Northern水平表达不同的两个独立株系进行进一步的生理测试。结果表明盐胁迫条件下转基因植株中Na~+含量明显高于野生型植株，盐耐受能力高于野生型植株，可能与Na~+区隔化能力的提高有关。