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小鼠胚胎细胞和体细胞核移植及原核置换研究

张刚  
【摘要】:细胞核与细胞质的关系是生物学的基本问题,核移植和原核置换是研究核质关系的重要方法。迄今为止,哺乳动物的原核置换研究主要在小鼠上进行。按照供体细胞的不同,哺乳动物核移植研究可分为两种:胚胎细胞核移植和体细胞核移植。小鼠是重要的发育模式动物,在已有的小鼠核移植报道中,胚胎细胞核移植和体细胞核移植分别采用不同的研究策略。胚胎细胞核移植一般采用融合的方法,而体细胞核移植一般采用胞质内直接注射的方法进行。 准确去除受体卵母细胞的细胞核是核移植研究的关键技术之一,在装备有Normarski 或Hoffmann 光学镜头的倒置显微镜下可以准确去除小鼠MⅡ期卵母细胞的细胞核。研究表明用适当浓度的蔗糖处理小鼠卵母细胞能准确去除细胞核。本论文的主要目的是改进和修改小鼠核移植和原核置换的实验程序,试图建立新的小鼠核移植和原核置换的可行方法。 1. 以致密桑椹胚卵裂球为供体克隆小鼠的研究 该研究以C57BL/6 小鼠致密桑椹胚卵裂球为供体、昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞为受体,研究了不同蔗糖浓度对核移植操作时间及重构胚体外发育的影响。实验结果表明:1)当分别用1%、2%和3%的蔗糖处理卵母细胞去核,去核率都可达100%,但是平均每个卵母细胞完成核移植操作所需的时间不同,分别为181.4±5.0s、125.9±3.9s 和114.2±2.3s,差异极显著(P0.01);2)当用不同蔗糖浓度处理卵母细胞进行核移植,重构胚的融合率分别为61.7%、61.4%和57.2%,桑椹胚/囊胚发育率分别为24.8%、28.7%和26.2%,差异不显著(P0.05)。将457 枚拟原核期和2-细胞期核移植胚胎移植入27 只代孕受体的输卵管中,其中一只代孕母鼠妊娠,并得到3只发育到期的死亡胎儿,表明蔗糖处理的去核卵母细胞能支持胚胎细胞核移植胚胎体内发育到期。 2. 以成年雄鼠耳成纤维细胞为供体克隆小鼠的研究 该研究以C57BL/6 成年雄鼠耳成纤维细胞为供体,昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞为受体,研究了3%蔗糖处理卵母细胞去核后,供体细胞不同传代次数和电融合次数对核移植重构胚体外发育的影响。实验结果表明:1)当分别以2-4、5-7、8-10 代的小鼠耳成纤维细胞为供体进行核移植时,不同传代次数的供体细胞对重构胚的体外发育没有显著影响,其桑椹胚/囊胚发育率分别为15.2%、13.3%和14.0%,差异不显著(P0.05);2)对核移植重构胚进行电融合,第一次电融合和第二次电融合的融合率分别为53.5%和59.8%,差异不显著(P0.05),但一次电融合重构胚的发育能力明显高于二次电融合的重构胚,其2-细胞发育率分别为65.7%和


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