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用于测定生物体内活性物质(自由基、金属离子等)的荧光探针的合成及分析应用

黄辉  
【摘要】: 随着生物化学与分子生物学的发展与各种物理、化学、生物学的研究手段的应用使生物体内的化学反应过程逐渐得到阐明。但是与此同时越来越多的实验证据表明在试管里研究得到的结果未必就完全反映了活体内的情况。因此,要真正了解生命,必须了解生物各种活性物质的实时变化。 目前,用于检测生物体内活性物质的方法有多种,如原子吸收光谱法,NMR光谱法,Electron probe microanalysis法等但它们的应用存在一些不足:(1)需要具有挥发性的样品;(2)应用于细胞内检测时需要较大量的细胞;(3)只能检测生物体系内的活性物质总量,从而导致其对目标被测物的选择性不高,或者虽能分别测定但却不能描述其在细胞中的分布(4)不能描述被测物在细胞内外的动态变化。至今为止人们尚无法直接动态观测到某些器官中活性氧自由基的产生,对它们的生成机制,生理作用及其动态损伤生物机体的过程都缺乏足够的认识和充分的实验证据,以至在临床上直接影响和限制了对许多疾病的治疗效果;对发展抗逆境植物的培植也是重大障碍。另外,对于金属离子的吸收、传输、分配、及其与蛋白质的等结合的关键因素还需进一步解释。因此,针对生物活体内自由基及金属离子开创新的分析与检测技术是分析化学学科发展中具有挑战性的前沿课题之一。 荧光光谱分析及成像技术由于其方法的灵敏度高、选择性好,在分析化学,特别是生物分析领域中应用广泛。大多数生物分子本身无荧光或荧光微弱,检测灵敏度较低,为使之高灵敏地检出,人们用荧光标记试剂或荧光生成试剂与待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,大大降低检出限。相对于常规荧光检测而言,在近红外荧光光区,生物样品基体光吸收或荧光强度很小,因而背景干扰大大降低。近红外荧光探针由于其特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的优点,且其测定条件适宜生命体的生理环境而被广泛地应用于生命科学研究领域。因此,设计合成对某种金属离子或自由基有高选择性和灵敏度,具有合适光谱性质的荧光探针,在化学环境下试验其性质,结合荧光成像技术,实时在线检测细胞内某种金属离子的浓度变化及在各个区域的分布,探讨各种金属离子在生命活动中所发挥的作用以及对某种离子的检测,探索自由基爆发时的致病机理,将为生物学以及医学的研究提供必要的依据。 荧光探针具有高灵敏度的优点,但是他的灵敏度却受到很多方面的影响,如光漂白、探针分子浓度的变化、探针分子所处的环境变化(如pH,极性,温度等等)以及光稳定性。荧光共振能量转移(FRET)原理可以克服这些缺点,从而可以用于选择性的检测自由基以及金属离子等。 本论文基于活性物质如自由基及金属离子与荧光探针作用导致荧光性质的改变以及荧光共振能量转移原理(FRET),开展了三方面的工作。 (一)设计合成了用于检测细胞内Zn~(2+)的近红外荧光探针——二(2-吡啶甲基)氨基花菁,用普通荧光法对锌离子进行定量分析测定,研究了反应机理,并将其用于细胞内Zn~(2+)的成像检测,为进一步研究用于细胞内成像的近红外荧光探针提供了新思路。 (二)用简便方法制取了荧光素酰肼,提高了反应产率,将其应用于对亚硝酸根离子的分析测定,优化了反应条件,将其应用于雨水样品及成年人血清中亚硝酸根的测定,并研究了其用于检测NO自由基的性质,建立了荧光法测定NO自由基的新方法。 (三)基于荧光共振能量转移原理(FRET)设计合成了一种能选择性检测镉离子的荧光探针,优化了反应条件。


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