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花生金属硫蛋白基因的克隆及AhMT2α基因的功能鉴定

全先庆  
【摘要】: 重金属污染是一个重要的环境问题,研究植物的重金属耐受和脱毒机制、克隆重金属代谢相关基因并研究其功能、利用植物修复技术清除受污染的土壤和水体中的重金属是当前的研究热点之一。一般认为,金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)在植物对重金属的耐受和脱毒、金属离子稳态的维持、必需金属离子的贮藏、胁迫响应、发育调节和活性氧清除等方面发挥着作用。目前,已有多例成功利用转基因技术过量表达MT基因提高植物重金属抗性和重金属累积量的报道。本实验以花生为实验材料,利用RT-PCR技术分离到3个编码type 2 MT的cDNA克隆,通过构建花生种子cDNA文库、大规模测序克隆到1个type 2、1个type 3和2个type 4 MT编码基因的cDNA序列,我们选择其中的1个type 2 MT编码基因AhMT2a (DQ178616)进行了功能分析,比较了在不同重金属和其它多种胁迫处理条件下基因的表达情况;构建原核表达载体转化大肠杆菌,测定了转化菌和对照菌的重金属耐受性和重金属累积量;构建植物表达载体转化拟南芥,测定了转基因拟南芥种子萌发及幼苗生长对重金属的耐受情况,主要结果如下: 1.本实验得到的4个type 2 MT编码基因的cDNA序列相似性很高,只有几个核苷酸差异,编码80或81个氨基酸残基,由AhMT2a和AhMT2b的核苷酸序列推导出的氨基酸序列完全相同。AhMT3a基因编码66个氨基酸残基,与type 2 MT一样具有2个Cys富含结构域。2个type 2 MT基因AhMT4a和AhMT4b的核苷酸序列相似性也较高,编码82个氨基酸残基,AhMT4a和AhMT4b只有5个氨基酸不同,都含有17个Cys残基,具有3个Cys富含结构域。 2.分别用300μmol/L CdCl2、200μmol/L ZnSO4和500μmol/L CuSO4处理花生幼苗15 d,测定不同营养器官中重金属的含量,发现镉与铜主要在花生的根部累积,锌主要在花生叶中累积,其中根中镉的含量分别为茎和叶中的5倍和8倍。根中较高的铜、镉含量与后面进行的分别用这两种金属处理后花生根中AhMT2a的mRNA含量增加相一致,表明AhMT2a可能主要与花生根中铜和镉的脱毒有关。 3.我们选择AhMT2a基因进行Northern杂交分析。由于花生基因组中含有多个type 2 MT基因,所以不能排除其它type 2 MT基因成员参与杂交的可能性。未施加任何胁迫时,AhMT2a在根、茎、叶等营养器官中都有表达,在老叶中的表达量最高,幼叶中的表达量较低,在成熟根中检测不到AhMT2a的表达,表明AhMT2a基因的表达没有明显的组织特异性。 用500μmol/L CuSO4或300μmol/L CdCl2处理花生幼苗促进AhMT2a基因在根和叶中的表达,表明AhMT2a可能在花生的根和叶中对镉、铜的代谢或脱毒过程中发挥作用,加之花生MT基因种类较多,可能不同的MT基因会在不同类型的重金属代谢或脱毒过程中发挥作用。用120μmol/L的ABA或42℃处理花生幼苗6 h,AhMT2a基因在叶和根中的表达量都有增加;用7 mmol/L的H2O2处理花生幼苗,AhMT2a基因在根和叶中的表达量随着时间延长依次增加;用200 mmol/L的NaCl处理花生幼苗,AhMT2a基因在根中的表达变化不大,12 h时表达量略有增加,AhMT2a基因在叶中表达的变化情况是:12 h和24 h处理时表达量比对照依次下降,而后又随着时间的延长表达量比对照依次升高。由以上结果分析并结合重金属处理后花生组织中的金属累积情况推测AhMT2a可能还与活性氧的清除有关。 4.构建了原核表达载体pET-AhMT2a,并将其转化到大肠杆菌BL21中。将表达AhMT2a的大肠杆菌的蛋白提取物用15%的SDS-PAGE进行分析,凝胶中出现了预想的大约11 kDa的条带。选用Pb~(2+)、Cd~(2+)和Cu~(2+)三种离子研究转化菌的重金属耐受性和累积量发现,表达AhMT2a基因的转化菌对以上三种离子的耐受性和累积量都高于转化了pET-28a的对照菌,其中铜的累积量约为对照的5.7倍,镉和铅的累积量约为对照的2倍,这些结果说明AhMT2a可能主要在铜的脱毒过程重发挥重要作用。5.筛选过量表达AhMT2a基因的拟南芥,得到26个纯合子株系。实验发现转基因拟南芥种子萌发时表现出高于对照的耐受Cd~(2+)和Pb~(2+)的能力,但耐受Cu~(2+)的程度与对照没有明显差异;转基因拟南芥幼苗在生长过程中都表现出高于对照的耐受Cd~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)的能力。我们测定了用Cd~(2+)处理以后的野生型和转基因拟南芥叶片的叶绿素含量、MDA和Fv/Fm,结果发现AhMT2a基因的转化降低了Cd~(2+)对拟南芥的毒害。在用不同成熟时期的花生种子构建的cDNA文库中,AhMT基因的ESTs约占总数的0.7%,表明AhMT2a可能还与种子的发育调节有关。 本论文的主要创新点: 1.首次利用RT-PCR技术和cDNA文库构建技术克隆到花生金属硫蛋白基因家族的3类共7个成员的cDNA。 2.对AhMT2a基因进行Northern杂交,发现该基因受Cu~(2+)、Cd~(2+)、ABA、42℃热激、H2O2和NaCl处理的诱导,表明AhMT2a基因可能与金属脱毒和活性氧的清除有关。 3.构建了原核表达载体和植物表达载体分别转化大肠杆菌和拟南芥,转化菌表现出较高的Pb~(2+)、Cd~(2+)和Cu~(2+)耐受性和累积量,转基因拟南芥种子萌发和幼苗生长也表现出高于野生型的耐受Pb~(2+)和Cd~(2+)的能力。 实验结果表明AhMT2a基因可能在花生的重金属脱毒和活性氧的清除中发挥作用。本工作对于更好地理解植物MT、更加深入地研究其功能具有一定的意义。


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