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盐地碱蓬阳离子转运载体SsHKT1的基因克隆及其功能分析

邵群  
【摘要】: 钾是植物中的重要元素,高亲和性的K~+吸收系统在钾的吸收及转运过程中起关键作用。植物HKT蛋白与原核生物中的KtrB、TrkH及KdpA转运载体、真菌中的Trk蛋白共同组成了一个超级转运载体家族, HKT蛋白已经引起广泛的注意,其功能逐渐被揭示。研究表明HKT转运载体在长距离的Na~+转运及植物耐盐性中起重要作用。目前报道的HKT基因大都来自非盐生植物如小麦、拟南芥、水稻及桉树等,只有McHKT1和McHKT2来自兼性CAM植物冰叶日中花。有关盐生植物中HKT转运载体的特性及功能研究的数据非常有限。本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)为材料,研究了盐地碱蓬中K~+、Na~+的吸收特性;克隆了盐地碱蓬质膜阳离子转运载体SsHKT1的基因并进行了表达特性的分析,同时构建了含有SsHKT1的酵母表达载体和植物表达载体,分别转化高亲和性K~+吸收缺陷的酵母突变体CY162、Na~+敏感的酵母突变体G19和野生型拟南芥,以分析此基因在不同的异源表达系统中所表现的主要功能及过量表达对拟南芥耐盐性的影响。主要结果总结如下: 1、低K~+条件下NaCl胁迫不影响盐地碱蓬中的K~+含量 K~+营养在盐地碱蓬生长中起关键作用。无NaCl胁迫(0 mmol/L NaCl)和NaCl胁迫(100,400 mmol/L)下,盐地碱蓬叶片和根系中的K~+含量均随K~+处理浓度的增加而显著增加。此外,较高K~+(0.7,1,6 mmol/L)浓度时,NaCl胁迫造成植株叶片、根系K~+含量明显下降。但较低K~+(0,0.1 mmol/L)浓度条件下,NaCl胁迫对叶片和根系的K~+的含量几乎没有影响;而且,在根中,无论是在低K~+浓度条件还是在高K~+浓度条件下,400 mmol/L NaCl胁迫与100 mmol/L NaCl胁迫相比,并没有使盐地碱蓬根中的K~+含量明显下降。由此可以看出,在盐胁迫下盐地碱蓬具有较高的维持K~+稳态的机制,这与非盐生植物明显不同,而K~+稳态对盐地碱蓬的耐盐性具有重要作用。 2、K~+吸收系统抑制剂对盐地碱蓬中Na~+积累的效应 在较低K~+浓度(0,0.1,0.4 mmol/L)条件下,高亲和K~+吸收系统抑制剂NEM(3 mmol/L)处理对盐地碱蓬植株内Na~+积累影响不大,Na~+积累并没有降低。这说明Na~+可能不是通过高亲和K~+吸收系统进入盐地碱蓬体内的。在较高K~+浓度(6,8,10 mmol/L)条件下,低亲和K~+吸收系统抑制剂TEA(6 mmol/L)对盐地碱蓬体内Na~+积累具有显著影响,它明显抑制了Na~+的吸收和积累(P盐处理VS盐处理~+TEA0.05)。这说明Na~+可以通过低亲和K~+吸收通道进入盐地碱蓬体内,TEA对低亲和K~+吸收系统的抑制也同时抑制了Na~+的吸收。 3、盐地碱蓬中阳离子转运载体SsHKT1 cDNA的克隆及序列分析 根据GeneBank中已知的HKT类蛋白的cDNA和蛋白序列寻找保守区并合成简并引物,用低K~+溶液处理盐地碱蓬幼苗16 h,提取根的mRNA并反转录成cDNA,以此作为模板进行PCR扩增,得到一条中间片段,经过测序并进行Blast分析与HKT的同源性较高。根据中间片段利用5’、3’RACE分别合成其5’、3’端序列,最终得到一条完整的HKT类基因,命名为SsHKT1。SsHKT1的cDNA(GenBank accession No.AY530754)序列全长2033 bp,包括54 bp的5'-非编码区和332 bp的3'-非编码区。开放阅读框为1650 bp,编码550个氨基酸残基,分子量约63.0 kD,SsHKT1氨基酸序列与其他植物HKT蛋白具有39%~64%的同源性。在SsHKT1的一级结构中推测的第一个P-环的GYG基序的第一个Gly并不存在,而是由Ser所替代。SsHKT1氨基酸序列的疏水性分析表明盐地碱蓬质膜SsHKT1为一跨膜多肽,存在10个可能的跨膜区。 4、盐地碱蓬根中SsHKT1的亚细胞定位 利用制备的SsHKT1的抗体SsHKT1Δ135-204进行盐地碱蓬根细胞质膜和液泡膜蛋白的免疫印迹杂交,发现SsHKT1蛋白分布在根细胞质膜上。 5、低K~+条件下盐地碱蓬SsHKT1基因的表达特性分析 分离盐地碱蓬植株的根、茎、叶总RNA,用半定量RT-PCR分析SsHKT1表达的组织特异性发现,SsHKT1主要在叶中表达,其次是根,在茎中没有检测到表达;在叶和根中SsHKT1的表达明显受到低K~+条件的诱导;在低K~+处理初期随处理时间的延长,盐地碱蓬叶片SsHKT1基因表达量增加,到48小时达到最大,随处理时间的延长,盐地碱蓬叶片SsHKT1基因表达量有所降低,但仍明显高于对照;较老的苗子中低K~+条件对于此基因的诱导作用弱于幼嫩的盐地碱蓬苗。这表明低K~+条件下,盐地碱蓬中SsHKT1基因表达存在动态变化。 6、盐胁迫条件下盐地碱蓬SsHKT1基因的表达特性分析 在低K~+条件下同时用200 mmol/L、400 mmol/L NaCl处理盐地碱蓬48小时,盐地碱蓬叶片SsHKT1表达量比单独用低K~+处理时增加,但两种盐浓度处理样品之间差别不大。 7、SsHKT1在酵母突变体中主要转运K~+而非Na~+ 酵母突变体CY162由于缺失高亲和性K~+转运载体基因Trk1和Trk2而在低K~+培养基上不能生长;突变体G19中负责编码Na~+外排的ATPases的ENA1~4基因缺失,造成Na~+敏感性增加,将SsHKT1利用LiAc转化方法分别转到酵母突变体CY162和G19中,发现CY162(SsHKT1)能在低K~+培养基上生长,而G19(SsHKT1)对Na~+的敏感性并未增加,初步说明SsHKT1主要转运K~+而非Na~+。 8、过量表达SsHKT1能够增加转基因拟南芥植株耐盐性 过量表达盐地碱蓬SsHKT1基因的拟南芥植株比野生型拟南芥植株耐盐性增加。在正常MS培养基上,转基因植株的生长与野生型植株没有明显差异,说明外源基因的插入和过量表达并没有影响植物的正常生长。在含不同浓度NaCl的MS培养基上萌发并生长的转基因拟南芥植株其叶色、根发育均明显好于野生型植株。将在MS培养基上生长10天的野生型及转基因拟南芥幼苗转移到0mmol/L K~+或含不同浓度LiCl的MS培养基上继续生长两周,转基因植株长势明显好于野生型植株。正常生长条件及不同处理的转基因土培苗地上部分的K~+积累明显高于野生型,而Na~+积累在两者之间没有明显差异。 综上所述,实验证据表明,SsHKT1在酵母细胞中表达时主要转运K~+而非Na~+;过量表达盐地碱蓬K~+转运蛋白基因SsHKT1明显提高了转基因拟南芥植株的耐盐性,这与酵母中的表达结果一致,进一步证实SsHKT1在维持正常的胞质K~+水平及植物抗盐性方面具有重要作用,为利用分子生物学手段进行作物耐盐新品种的培育奠定了一定基础。 本论文主要创新点: 1、首次从盐生植物盐地碱蓬中克隆了SsHKT1基因。 2、证明了SsHKT1基因的表达受K~+饥饿及盐胁迫的诱导。 3、证明了转SsHKT1基因酵母菌的耐盐性提高。 4、证明在拟南芥中过量表达SsHKT1基因可以提高转基因植株的耐盐性。


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