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用于活细胞内金属离子原位成像的研究及应用

张文申  
【摘要】: 随着生物化学与分子生物学的发展与各种物理、化学、生物学的研究手段的应用,使生物体内的化学反应过程逐渐得到阐明。但是,与此同时越来越多的实验证据表明在试管里研究得到的结果未必就完全反映了活体内的情况。因此,要真正了解生命,必须了解生物各种活性物质的实时变化。 荧光光谱分析及成像技术由于其方法的灵敏度高、选择性好,在分析化学,特别是生物分析领域中应用广泛。大多数生物分子本身无荧光或荧光微弱,检测灵敏度较低,为使之高灵敏地检出,人们用荧光标记试剂或荧光生成试剂与待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,大大降低检出限。此外,借助于荧光共聚焦成像技术可以绘制活细胞内离子的时空分布。因此,设计合成对某种金属离子或人体内的其它活性物质有高选择性、灵敏度以及合适光谱性质的荧光探针,结合荧光成像技术,实时、在线检测细胞内某种金属离子的浓度变化及在各个区域的分布,探讨各种金属离子在生命活动中所发挥的作用以及对某种离子缺陷时出现的病理进行研究,实现自由基的生物活体内(in vivo)与直接原位(in situ)的检测,探索自由基爆发时的致病机理,将为生物学以及医学的研究提供必要的依据。目前,荧光探针已经被广泛的应用于细胞内许多物种的检测,如锌离子,超氧自由基,柠檬酸根离子,单线态氧以及一氧化氮自由基等等。 众所周知,人体内的金属离子在许多生理过程中都发挥着重要的作用。其中,铜离子是人体的一种必需微量元素,其参与体内许多生化反应,如:维持铁的代谢平衡;参与细胞内的呼吸;作为辅助因子,参与酶的功能性活动等等。但是,如果生物体内,有机组织中,以及活细胞内的铜离子稳态水平失调,则可导致严重的神经变性疾病,包括门凯氏病和肝豆状核变性征,家族性肌萎缩性侧索硬化,阿尔茨海默病,以及疯牛病等.。一方面,适量的铜离子对于生命体起着重要的作用;另一方面,过量的铜离子有机体有很大的毒害作用。因此,研究铜离子在生物组织甚至活细胞中的动态原位成像对于阐明其在生理及病理中的作用非常有意义。 H+也是细胞中一种重要的目标靶分子。众所周知,细胞内的H+浓度变化对细胞生长,细胞凋亡,钙调控作用,细胞内吞作用,细胞趋化作用以及其它细胞活动起了重要的调控作用。因此,对活细胞内的pH变化进行动态检测,进而进行相关功能研究,对于认识生命过程及剖析重大疾病发生机制都具有重要意义。 此外,人体内的许多阴离子在生物过程中扮演着十分重要的角色,许多酶的反应中都需有阴离子参与。氟,是人体必需的微量元素之一,也是有毒有害元素,缺乏或过量均会引发各种疾病;过量氟对蛋白质和DNA的合成具有抑制作用,对动物的造血功能有明显影响,能阻止原卟琳的合成,使血红蛋白减少,从而导致贫血。高氟还会使与钙、锰、镁、铜、铁、锌等有关酶的活性降低,直接导致脂肪的利用率下降及糖代谢紊乱,从而影响动物的生长发育。氟离子还能促进自由基的氧化过程,其含量多少与自由基的生理作用有着重要的关系。迄今,如何获得对氟离子的专一性的识别以及如何将这种识别转化为检测信号仍是问题的关键。目前,科研工作者已成功的研制出了多种用于检测环境及饮用水中氟离子的荧光探针。但是,至今能真正适用于检测活细胞内氟离子水平以及用于细胞内氟离子荧光成像的荧光探针还未见诸报道。 本论文基于生物体内的金属离子,氢离子以及阴离子,如:氟离子等,与荧光探针作用导致荧光性质的改变,开展了三方面的工作。 (一)设计并合成了一种基于罗丹明染料的新型荧光探针,能选择性检测模拟生物体系内的Cu2+,实现了对RAW264.7巨噬细胞中的Cu2+荧光成像。 (二)设计并合成了一种基于罗丹明染料的新型荧光探针,该探针对H+具有非常高的灵敏度,选择性检测了pH的变化,并实现了对肝癌细胞中的氢离子的荧光成像。 (三)提出了一种新型的用于检测生物体内氟离子的荧光探针,描述了它的设计及合成。


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