蛋白质寡核苷酸适配体的筛选与应用研究

【摘要】： 适配体(aptamer),又称适配分子或适配子,来源于拉丁语aptus(匹配的意思)和希腊语‘‘meros’’(即小的颗粒)。寡核苷酸适配体是通过指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment , SELEX)技术从体外筛选得到的能与相应配体专一性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。这段序列可以是RNA、修饰RNA、ssDNA或dsDNA。适配体的配体广泛并且性质各异,除了蛋白质等大分子外,还有染料、金属离子、药物(咖啡因和茶碱等)、辅因子、生长因子、类固醇、糖类、氨基酸等小分子,甚至是完整的细胞、病毒、孢子等超分子,难用做半抗原的毒素和阮病毒也可以作为靶分子。 适配体与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下,它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳定的三维空间结构。核苷酸与配体间有较大的接触面积,能形成许多潜在的结合位点,这一优势使适体能识别配体间一个基团的细微差别。经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高,kd值多在pmol/L~nmol/L之间。 SELEX技术筛选一般需要5-18个筛选循环,约2-3个月时间。目前人们筛选过程逐步实现自动化,节省了人力物力,筛选时间也大大缩短。 作为寡核苷酸的适配体分子变性后,在适当条件下可以发生复性,另外,适体分子经过适当的化学修饰,能抵抗核酶的降解,延长半衰期,大大提高其稳定性,并可以长期保存并在常温下运输,这对实验诊断试剂或是临床治疗等方面都非常有利。因此,基于以上有利条件,适配体已经被广泛应用于分析化学、基因调控、蛋白质组学和新药研发等领域。 在适配体筛选研究中,我们将卵黄蛋白原等五种蛋白为靶蛋白,包被于96孔板上。体外合成一个全长80bp,中间包含40个任意碱基的ssDNA文库,以结合固定于板空上的靶蛋白,运用RT-PCR技术检测每轮ssDNA文库与靶蛋白的亲和力。本试验以ELISA技术进行适配体筛选技术方法平台搭建,为建立适配体筛选实验室方法奠定基础。 在适配体应用研究中,我们以一种高亲和力适配体作为亲和荧光探针,采用自建的毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测装置,建立了一种高灵敏、快速测定人凝血酶的方法。荧光标记的凝血酶适配体特异性地与凝血酶结合并形成稳定的凝血酶-适配体复合物,采用CE-LIF对复合物进行分离检测从而测定凝血酶浓度。本工作探讨了盐离子种类及浓度对适配体与凝血酶结合的影响,并在选定的电泳条件下对凝血酶检测的线性范围、检出限和重现性进行了测定。结果表明,盐离子存在的条件下适配体与凝血酶的亲和力降低,不利于两者的结合;人血清溶液中,凝血酶浓度在0.25-10 nmol/L范围内与复合物峰面积具有良好的线性相关性(Y = 1.2×105x+5.33×104,r2 = 0.991),最低检出限为55.6 pmol/L;精密度试验和回收率试验结果均满足分析要求。