肽链修饰的荧光探针测定活性生物分子的研究及应用

【摘要】： 荧光技术是生物化学和细胞生物学研究的重要工具。随着落射荧光显微镜,激光共聚焦荧光显微镜,多光子荧光显微镜的发展,实现了分子、酶等生物活性物质的精确检测和可视化。肽链修饰的荧光探针作为一类重要的荧光成像探针在生物成像与检测中越来越受到重视。为了检测生物体内不同的活性靶分子,肽链修饰的荧光探针的设计越来越灵活。主要可以分为三类:靶向探针,交联成像探针和酶活性荧光成像探针。这些探针不仅在体外和动物模型中有所应用,而且在研究药物机理和疾病检测中起到重要的作用。 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)作为重要的光物理技术已广泛应用于生物大分子之间距离的定量检测,在蛋白质、核酸、细胞器结构功能研究,免疫分析,金属离子测定等领域都有巧妙而有效的应用。FRET也称为非辐射能量转移,即处于激发态的物种以偶极-偶极相互作用形式将激发能转移给处于基态的物种,传递距离在20~80 ?之间。其中,能量给予者为供体(donor),能量接受者为受体(acceptor),受体可发射自己的特征荧光(荧光增强),也可不发荧光(荧光猝灭)。纳米金良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、光学效应、特殊的生物亲和效应,以及对荧光试剂高的猝灭效率,提高了FRET过程的灵敏度和特异性,使其成为一个研究和应用的热点。 酶是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质,是维持机体正常功能、消化食物、修复组织等生命活动的一种必需物质。它几乎参与所有的生命活动。蛋白酶对机体的新陈代谢以及生物调控起重要作用。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是降解细胞外基质成分的一类含Zn2+水解酶,是肿瘤细胞侵袭及转移的关键因素。探讨MMPs在不同类型肿瘤及在不同表型的分泌和表达水平,对肿瘤的预防、诊断及预后有重要意义,也可为肿瘤治疗提供新的方向和策略。 利用FRET原理设计合成肽链荧光探针是设计蛋白酶成像探针的主要方法,然而同时检测两种蛋白酶的探针还未见报道。本文基于FRET原理,建立纳米金-肽-铕螯合物-香豆素复合体系检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-7(MMP-7)酶活性的新方法。纳米金具有高消光系数,在纳米金-肽-铕螯合物-香豆素构成的双FRET供受体对中起到荧光猝灭作用。基质金属蛋白酶水解肽链使其断裂导致FRET现象消失,纳米金猝灭铕螯合物的荧光和香豆素的荧光随之得到恢复,据此实现两种基质金属蛋白酶的测定。鉴于恶性表型和侵袭转移表型的细胞均高水平表达基质金属蛋白酶,本方法可用于评价细胞癌变恶性程度。 氧自由基几乎和人类大部分常见的几种主要疾病如心脏病、癌症、恶性肿瘤等都有关系,同时,人体本身存在有两大抗氧化系统。至今为止,对直接动态观测某些组织、器官中氧化还原的过程都缺乏足够的认识和充分的实验证据,以至在临床上直接影响和限制对许多疾病的治疗效果。基于FRET原理设计合成了一种动态实时监测细胞内氧化还原过程的荧光探针Dabcyl -GCVSGTCK-11-MUA-LAuND。当探针处于氧化态时,两个Cys形成二硫键,肽链发生β折叠,11-MUA-LAuND和Dabcyl发生荧光共振能量转移,11-MUA-LAuND的荧光被猝灭。当探针处于还原态时,二硫键断裂,肽链的β折叠结构被破坏,供受体分离,11-MUA-LAuND的荧光恢复,通过检测荧光强度的变化来检测氧化还原态的变化。预计可实现细胞内氧化还原状态的实时动态监测。