盐地碱蓬酪氨酸酶酶学特性及其基因克隆

【摘要】： 盐地碱蓬在地势较高或者距离海边较远的地方呈现绿色,而在滨海的潮间带或者部分涝洼积水地带整个生长期植株地上部分皆为紫红色,该颜色表型差异源自盐地碱蓬植株体内甜菜红素含量的不同。盐地碱蓬作为一种真盐生植物,其耐盐机理已得到了较为广泛的研究。但是盐地碱蓬甜菜红素生物合成的分子机理及其合成过程中相关酶的酶学特性的研究至今尚未见报道。深入研究盐地碱蓬甜菜红素积累的机理,对于揭示盐生植物的光合作用、生态进化、耐盐适应、生长发育及环境因子对其表型影响具有重要意义。甜菜素合成途径相关酶的功能定位、特性分析、基因克隆以及相关基因表达调控的研究也是需要深入的领域。本文研究了盐地碱蓬甜菜红素合成过程中的第一个关键酶——酪氨酸酶的酶学特性,并克隆了其基因片段,为深入研究盐地碱蓬酪氨酸酶在甜菜素合成中的作用及其与环境之间的关系奠定了基础。研究结果如下: 在高等植物中,酪氨酸酶一般被称为多酚氧化酶,但在盐地碱蓬等合成甜菜素的植物中其酪氨酸酶不同于其它高等植物的多酚氧化酶,它具有很高比例的羟化酶活性,而通常高等植物中的多酚氧化酶没有羟化酶活性或羟化酶活性很低。本实验以黑暗培养3天的盐地碱蓬幼苗为实验材料,确定了盐地碱蓬酪氨酸酶的提取及其活性分析技术,并首次研究了其相关的酶学特性。盐地碱蓬酪氨酸酶氧化活性的最适温度为35℃,最适pH值为6.6 ,最适条件下Km=1.09 mmol/L,Vmax=71.43μmolg-1min-1。Na2S2O3是酪氨酸酶氧化活性的强效抑制剂。0.01 mmol/L的Cu2+可以显著激活酪氨酸酶的氧化活性,为对照的128.2 %。酪氨酸酶羟化活性的最适温度为40℃,最适pH值为6.6,最适条件下Km=3.16 mmol/L,Vmax=0.645μmolg-1min-1。Na2S2O3是酪氨酸酶羟化活性的强效抑制剂。0.01 mmol/L的Cu2+可以显著激活酪氨酸酶的羟化活性,为对照的126 %。盐地碱蓬酪氨酸酶酶学特性的研究,为进一步研究盐地碱蓬生长发育及环境因子对酪氨酸酶表达和活性的影响,及酪氨酸酶在甜菜素合成过程中的作用奠定了基础。 目前在高等植物中,包括合成甜菜素的高等植物美洲商陆、太阳花中也只克隆得到多酚氧化酶的cDNA序列,没有克隆酪氨酸酶基因序列。由于不确定盐地碱蓬酪氨酸酶与高等植物的多酚氧化酶亲缘关系近还是与真菌或动物的酪氨酸酶亲缘关系近。所以,本实验只能从GeneBank中选取有代表性的菠菜多酚氧化酶、美洲商陆多酚氧化酶、烟曲霉酪氨酸酶、苹果多酚氧化酶、梨多酚氧化酶和花菇酪氨酸酶的蛋白序列,在线CLUSTAL比对,确定酪氨酸酶的保守区域——两铜离子结合位点设计简并引物,以盐地碱蓬总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了500 bp的保守片段;核苷酸序列BLAST结果显示该片段与美洲商陆的多酚氧化酶的同源性高达71%,初步认为该序列即为盐地碱蓬编码酪氨酸酶两铜离子结合位点间的基因序列,这为克隆酪氨酸酶基因全长及深入研究盐地碱蓬酪氨酸酶在甜菜素合成中的作用及其与环境之间的关系奠定了基础。 在黑暗培养3天的盐地碱蓬幼苗中检测到很高的酪氨酸酶活性。但实验中选取萌发24 h,36 h,48 h,72 h的幼苗提取RNA反转录,进行多次3'-race及5'-race均没得到理想结果。考虑到可能3'-race及5'-race对目标RNA的含量要求较高,而选取的实验材料中酪氨酸酶的RNA含量较低。因此,推测盐地碱蓬种子成熟过程中合成了酪氨酸酶供种子萌发时使用,在黑暗中萌发的盐地碱蓬种子酪氨酸酶基因没有表达,其RNA含量较低。所以,设计实验对未萌发的盐地碱蓬种子中酪氨酸酶的活性进行了研究。结果表明吸胀0 h、0.5 h、5 h的未萌发的盐地碱蓬种子中均检测到很高活性的酪氨酸酶。这说明黑暗培养3天的盐地碱蓬幼苗表现紫红色主要是由于种子中的酪氨酸酶起作用,其酪氨酸酶基因表达量很低。这也进一步说明选取黑暗萌发的盐地碱蓬幼苗提取RNA反转录克隆酪氨酸酶基因是不合适的。这为下一步确定克隆酪氨酸酶基因的合适材料奠定了基础。 我们以前的研究发现,盐地碱蓬的愈伤组织在黑暗条件下不能合成甜菜红素,只有在光下才能合成。同时许多文献也报道真菌中的酪氨酸酶是光启动的。实验中将黑暗培养48 h的盐地碱蓬幼苗移到光下后,研究其酪氨酸酶活性的变化,结果表明黑暗培养48 h的盐地碱蓬幼苗移到光下后其酪氨酸酶的氧化活性与羟化活性均表现先升高后降低的趋势。这说明光照确实可以增强盐地碱蓬酪氨酸酶的活性,并且光照时间过长又会导致其活性降低。