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黑线仓鼠OT/OTR的结构分析与差异表达研究

张之一  
【摘要】:黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是华北地区农业害鼠的优势种,其高繁殖力是影响其种群数量的主要原因之一,因此研究黑线仓鼠的繁殖机制显得尤为重要。本文从繁殖相关基因入手,从分子水平上揭示害鼠种群数量波动机制,对鼠害的综合防控提供新的思路。催产素基因(Oxytocin,OT/Oxt)是与动物繁殖行为密切相关的基因,催产素通过与催产素受体(Oxytocin Recepter,OTR)的结合,不仅与分娩、射乳有关,还影响着动物的择偶、攻击等多种行为。本研究通过分析黑线仓鼠OT及OTR的cDNA序列,预测蛋白质的分子结构,并分别检测两者在不同发育阶段和不同组织器官中的表达情况,预测催产素在黑线仓鼠生长、发育以及繁殖过程中所起的作用,从而从分子生物学角度寻找控制黑线仓鼠数量及其危害性的有效方法。 本研究以山东省曲阜市吴村镇和沂南县蒲汪镇的农田里捕得的黑线仓鼠为研究对象,用RT-PCR方法分别克隆OT和OTR的部分cDNA序列。其中,OT cDNA序列314bp,GenBank登录号:JQ416144;OTR cDNA序列442bp,GenBank登录号:JN180665。采用分子生物学软件对两者的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析,并预测其蛋白质二级、三级结构。研究结果表明:OT编码区的C-Y-I-Q-N-C-P-L-G9个氨基酸残基构成成熟的OT分子,第一位和第六位的两个Cys之间形成一个二硫键,这9个氨基酸残基之后的部分则形成OT的运载蛋白,其二级结构中含有较多的β转角,同时应用SWISS-MODEL蛋白质同源模建服务器预测得到了OT运载蛋白的部分三级结构。OTR的这部分序列包含完整的OTR的7个跨膜螺旋中的第2、3、4跨膜螺旋和第5跨膜螺旋的一部分,推测第2跨膜螺旋之前的一个胞膜外结构域与OT羧基端的结合有关,后一个胞膜外结构域与OT环状结构的识别有关,第3和4跨膜螺旋结构参与OT分子识别的过程。此外这部分序列中有一个潜在的磷酸化位点和一个潜在的二硫键,4个连续的L结构在稳定蛋白质三维结构过程中起着重要的作用。用SWISS-MODEL蛋白质同源模建服务器预测分别得到了其57~87位和1~147位氨基酸的三级结构。使用DNAMAN分别将黑线仓鼠OT和OTR的cDNA序列与大鼠、小鼠、人等几个物种的相应cDNA序列进行同源性对比分析,发现黑线仓鼠与草原田鼠(Microtus ochrogaster)、金仓鼠(Mesocricetus auratus)亲缘关系最近,与大鼠、小鼠较近,与偶蹄目和灵长目的几个物种亲缘关系均较远。 随后,本研究还采用实时荧光定量PCR方法分别比较OT和OTR在雌雄黑线仓鼠亚成年期、成年发情期以及老年期三个发育时期以及脑、心脏以及生殖器官中的相对表达量。结果发现:OT主要在脑中表达,OTR则主要在外周器官表达,因此认为OT虽然主要在脑中产生,但发挥生理作用的部位主要在外周器官,这与经典的OT神经内分泌调控机制相一致。在发情期,OT在脑和卵巢中表达均较高,提示了OT对动物发情行为具有一定影响。在雌性个体的生殖器官中,尤其是子宫中,OT的表达量在成年发情期和老年期远远高于亚成年期,间接说明在亚成年期子宫发育尚未完全,结果提示,测定蛋白类激素基因表达量的方法有助于确定雌性黑线仓鼠与发情、生殖有关的发育状态。另外,发现OT和OTR在亚成年期个体心脏中均具有较高的表达量,推测OT对黑线仓鼠心脏发育及其功能发挥有重要的调节作用,其具体作用机制还需进一步深入的研究。从整体来看,器官差异产生的OTR表达量的差别大于发育时期不同产生的表达量的差别,但是对于OT,在特殊器官和特定发育时期,其表达量的变化都比较明显。 总之,研究OT对动物行为的调节不能孤立地研究OT的分子结构及其表达量的变化,应结合与其密切相关的受体OTR以及其他一些相关基因综合来研究。


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