人脐带Wharton's jelly间充质干细胞的生物学特性以及其与脑肿瘤干细胞共培养的实验研究

【摘要】： 背景与目的： 肿瘤干细胞学说这一概念的提出距今已有30多年的历史,该学说认为肿瘤组织中存在极少数具有自我更新和分化潜能的肿瘤细胞,并且是肿瘤增殖、生长、转移和复发的根源。1992年Reynolds对小鼠脑细胞的研究提出了神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)概念,1997年Mckay在Science上发表NSCs的文章得到了公认。而2003年Singh从不同病理类型的人脑肿瘤中培养、鉴定出了一种拥有增殖、自我更新和分化能力并且表达神经干细胞表面标记物CD133的脑肿瘤干细胞(Brain Tumor Stem Cells, BTSCs)。近年来,大量研究证实,BTSCs是脑肿瘤的起源细胞,在肿瘤的发生、发展过程中起决定性作用,也是脑肿瘤对放射治疗和化学治疗产生耐受的根源所在,使得BTSCs成为治疗脑肿瘤的新靶点。而BTSCs相关分子标记物及其致瘤机制是神经肿瘤研究的热点领域,也为未来脑肿瘤的研究和临床治疗指明了方向。人们证明,移植后的NSCs具有向脑肿瘤定向迁徙的能力,能在肿瘤周边增殖并包绕脑肿瘤,从而降低脑肿瘤的侵袭性。然而宿主对NSCs移植的排斥和NSCs移植后潜在的致瘤性以及组织来源的伦理问题使得人们把目光投向了间充质干细胞(Mesenchymal Stromal Cells, MSCs)。 MSCs是来源于中胚层的多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能,在适宜的体内体外环境下可以分化为造血细胞以及多种组织特别是中胚层组织细胞的能力,甚至还具有跨胚层分化为神经外胚层起源组织细胞的潜能,因而具有高度的可塑性,是细胞移植和组织工程的新型种子细胞,具有广阔的应用前景。以往研究的重点放在骨髓MSCs的研究上,而其它组织中也存在有MSCs,包括动员的外周血、脐血、乳牙、脂肪、胎盘等,然而,从这些组织中得到的细胞数量有限,从而限制了其研究发展。 人脐带Wharton's jelly间充质干细胞(Mesenchymal Stromal Cells derived from Wharton's jelly cells, WJCs)满足了国际细胞治疗协会规定的MSCs的特点：如贴壁生长,自我更新,表达MSCs共有的表面标记物,能够向骨、软骨、脂肪、肌肉、神经细胞诱导分化,能够支持其它干细胞的扩增,对免疫系统有良好的耐受性,对肿瘤有定向迁徙的特性。WJCs通过其营养支持和免疫调节作用对很多临床前期的人类疾病的动物模型有治疗作用,如神经退行性疾病,肿瘤,心脏病等。而且脐带组织来源广泛,不存在伦理学问题。因此,本实验主要研究WJCs的生物学特性,以及WJCs和BTSCs在体外共培养后,WJCs是否能够影响BTSCs的生物学特性,并为细胞治疗提供理论依据。 方法： WJCs的分离、培养：取长约10cm脐带,剥离脐带外膜并将两条脐动脉和一条脐静脉分离去除,保留Wharton's jelly,并用PBS缓冲液充分冲洗并将其剪碎至2mm×2mm×2mm大小组织块,置于T25培养瓶中,加入含有20μg/L的bFGF和体积分数为10%的FBS的DMEM/F12培养基5ml培养。 WJCs免疫表型鉴定：流式细胞仪检CD29、CD44、HLA-ABC、HLA-DR、CD34、CD45。 WJCs免疫荧光鉴定：GFAP和Nestin。 比较脐带Wharton's jelly不同时间产出原代WJCs的免疫表型变化：流式细胞仪检CD29、CD44、HLA-ABC。 CCK-8法比较Wharton's jelly不同时间产出原代WJCs增殖能力变化：绘制7天细胞生长曲线。 BTSCs的分离、培养：将新鲜的肿瘤组织用PBS缓冲液充分冲洗并去除外周坏死组织和毛细血管,在80目滤网中研碎过滤后加入2.5g/L胰酶和1.0g/L胶原酶Ⅳ37℃消化30分钟,将消化液过200滤网后制成单细胞悬液。计数活细胞,以2×105／ml终浓度接种于无血清培养基(Serum-free medium, SFM)中,置于T75培养瓶中,添加培养基至10ml培养。 BTSCs免疫表型鉴定：流式细胞仪检CD133 BTSCs免疫荧光鉴定：GFAP和Nestin CCK-8法检测BTSCs增殖率：绘制7天细胞生长曲线。 WJCs与BTSCs共培养实验：应用不添加任何生长因子的无血清培养基将两种细胞在24孔板中进行直接共培养。第3、7天时分别离心收集孔中悬浮细胞,应用流式细胞术检测BTSCs CD133表达；贴壁细胞应用免疫荧光法检测神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达；将第3天离心所得的共培养上清液(Co-culture supernatant, CCS)重悬第3代BTSCs并与正常培养悬浮的第3代BTSCs置入96孔板中,应用酶标仪检测两组细胞生长曲线的差异。 结果： WJCs的原代培养和扩增：组织块贴壁3-5天后可零星见到单个的梭形或三角形的贴壁细胞,1周后可见贴壁组织块周围有细胞向外游出,细胞由多层逐渐变为单层,细胞由密集变为松散,体型由小到大,细胞形态多为饱满的长梭形或扁平形的成纤维样细胞,核仁明显。两周后,细胞形态变为均一的纺锤形,形态类似成纤维细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长。 流式细胞仪检测第3代WJCs显示：高表达CD29(91.50%)；低表达CD44(36.92%)、HLA-ABC(28.10%)；不表达CD34(0.72%)、CD45(0.11%)和HLA-DR(0.80%) 对WJCs进行Nestin和GFAP免疫荧光染色后显示：未经诱导的WJCs在荧光显微镜下不发出荧光,即不表达Nestin和GFAP。 比较脐带Wharton's jelly不同时间产出原代WJCs的免疫表型变：流式细胞仪检测CD29,CD44,HLA-ABC变化无统计学意思。 CCK-8法比较Wharton's jelly不同时间产出原代WJCs增殖能力变化：不同时间Wharton's jelly产生原代WJCs的增殖曲线无差别。 BTSCs的原代培养和扩增：接种细胞1天后,倒置显微镜下观察可见大量悬浮生长、形态多样的肿瘤细胞团和一些悬浮生长的单细胞,折光性不明显。7天后可见由2-5个细胞组成大小不等的悬浮细胞球。10天后见细胞球明显增多,体积增大,形状规则且折光性强。将细胞球吹散后传代培养,大部分1天后形成新的细胞球。 BTSCs巢蛋白Nestin和GFAP免疫荧光鉴定：未经诱导的BTSCs表达Nestin而不表达GFAP。 WJCs与BTSCs共培养：倒置显微镜下可见：单独孵育WJCs 24h后用PBS冲洗24孔板,去除未贴壁的细胞,板内可见大部分呈梭形,胞核呈卵圆形,散在均匀分布生长的典型WJCs。共培养1天后,可见两种现象：一种是BTSCs能够形成典型的肿瘤干细胞球,球体圆形或椭圆形,大小不等,折光性强,每个视野能见到3-5克隆团且与贴壁的WJCs相粘连,而WJCs形态数目与WJCs阴性对照几乎无差别；第二种是BTSCs很难形成肿瘤干细胞球,多为单细胞均匀分散,漂浮在培养液里,覆盖在WJCs之上,而WJCs与WJCs阴性对照相比增殖迅速,形成很多细胞集落,胞体伸长形成细胞间连接,方向不整。BTSCs阴性对照开始形成典型的肿瘤干细胞球漂浮在培养基中并且可以滚动。 共培养3天后,可见两种现象：一种是与WJCs相连的BTSCs球体发生贴壁现象,肿瘤细胞从球体周围向外游出,形态多为星形,梭形,形成细胞突触呈放射状,并且与周围增生的WJCs形成连接,细胞体积比WJCs小很多,球体周围有一些单个的肿瘤细胞脱落漂浮在培养基中,WJCS增生明显尤其是与BTSCs连接处的WJCs形成细胞集落较多,细胞体积开始变大包体伸长；第二种是BTSCs依然分散漂浮在培养基中,形态与共培养1天时无差别,而WJCs增生明显占据视野的70%,细胞扁平宽大伸长。BTSCs阴性对照依然是典型的肿瘤干细胞球,WJCs阴性对照细胞数目变化不大,形态增大伸长,但依然是梭形。 共培养7天后,可见两种现象：一种是肿瘤干细胞球贴壁分化的细胞增多,整个球体紧贴在孔底,BTSCs与WJCs之间的链接更加紧密,WJCs与WJCs阴性对照相比包体较大扁平；第二种是BTSCs散落在WJCs之间,有的单细胞紧紧贴在孔底上,多为星形。 通过检测共培养的BTSCs的免疫表型可以得到：脑肿瘤级别高的组织分离得到的BTSCs表达CD133较高,与WJCs共培养后可以看到随着共培养天数增加,BTSCs表达CD133的量逐渐减少。 第3天离心所得的共培养上清液重悬第3代BTSCs与正常培养基培养的第3代BTSCs生长曲线的对比,在共培养上清液中培养的BTSCs比在正常培养基中培养的BTSCs的生长曲线要平。 结论： 1.成功使用组织块法在体外培养出WJCs,并能将脐带组织块充分利用获取更多间充质干细胞,以及采用酶消化法从胶质瘤组织中成功分离出BTSCs,通过换液法尽可能到纯化干细胞。 2. WJCs与BTSCs共培养后在倒置显微镜下可见脑肿瘤干细胞球随着培养时间的增加出现分解、贴壁、分化现象；贴壁的脑肿瘤干细胞免疫荧光染色GFAP和Nestin均阳性,WJCs能促使BTSCs分化。 3.恶性程度高的脑肿瘤组织培养的BTSCs表达CD133量越高,而与WJCs共培养后随着时间的变化均出现CD133表达量降低,WJCs与BTSCs体外共培养后可降低BTSCs表面标记物CD133的阳性率表达。 4.共培养上清液培养的BTSCs与正常培养基培养的BTSCs相比,增殖能力明显受到抑制,WJCs能够分泌抑制性因子产生对BTSCs的抑制作用。