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禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选

邬成业  
【摘要】: 禽流感(Avian Influenza AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的一种禽类全身性或呼吸器官性传染病。禽流感呈世界性流行,是目前影响世界养禽业的最严重疫病之一,它不仅给养禽业造成了巨大的危害,而且也能感染人并导致死亡,给人类的健康带来了巨大的威胁。针对禽流感流行的严峻状况和目前尚无治疗的特效药物,迫切需要研制一种能预防高致病性禽流感的广谱性疫苗,从而有效地预防和控制禽流感,促进畜牧业的迅发展,保障人们的身体健康。 在禽流感病毒主要组成蛋白中,核衣壳蛋白(NP)基因在A型流感病毒中同源性较高,保守性较强,具有型特异性,因此建立在NP蛋白基础上的多肽疫苗对AIV的预防将更具有意义。 参考Genbank上发表的H5型禽流感病毒(A/chicken/Henan/01/2004(H5N 1))基因序列,利用PCR方法从质粒T-NP上扩增NP基因,然后构建成重组表达质粒pET32a-NP并转化大肠杆菌Rosetta,经酶切及PCR方法鉴定筛选出阳性克隆。测序证明,目的基因正确插入表达载体,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集不同诱导时间的菌液进行SDS-PAGE,结果表明AIV NP基因在大肠杆菌中以可溶的形式高效表达,分子量约为70kD,且能与H5N1亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。将表达蛋白经镍柱纯化后作为抗原对2月龄鸡进行免疫,三免后测得免疫后鸡抗体效价达104以上。同时用计算机预测NP的T细胞抗原表位并利用固相多肽合成(SPPS)方法将其合成,分离免疫鸡的外周血单核细胞(PBMC)调整浓度至2×106个/mL铺96孔细胞培养板,过夜后将预测合成的多肽用PBS溶解后以20μg/孔加入细胞中,用加入终浓度为15μg/mL的ConA为阳性对照后,MTT法检测结果表明P1-2(NP36),P1-3(NP380),P3-9(NP155)反应效果较好,可能是禽流感病毒核衣壳蛋白T细胞抗原表位。


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