HL-60白血病细胞诱导分化后NS基因表达变化与NF-κB和CyclinD1、A关联性的研究

【摘要】： 目的： 核干细胞因子(nucleostemin,NS)是2002年发现的与干细胞和肿瘤细胞增殖有关的一种p53结合蛋白,表达于干细胞和肿瘤细胞的核或核仁中,在细胞质中有低水平表达。NS蛋白在肿瘤细胞和干细胞自我复制和无限增殖中起着重要作用,可能是肿瘤细胞和干细胞穿越G2/M检验点的特异性调控因子,并抑制其向成熟细胞分化。本课题先前的研究发现在白血病细胞系K562、HL-60细胞以及不同类型的急性白血病细胞中均存在NS基因高表达的现象,并且随细胞的分化成熟,NS的表达水平逐渐降低。在体外用不同浓度的全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化,发现ATRA诱导HL-60白血病细胞分化过程中NS基因和蛋白的表达下调,提示在ATRA诱导白血病细胞重新分化的治疗机制中有NS的参与。本研究以前期的研究结果为基础,在体外以ATRA诱导HL-60细胞分化,检测分化过程中NS、NF-κB、Cyclin D1、Cyclin A的变化,以探讨NS和NF-κB、Cyclin D1、Cyclin A之间的关系,为进一步研究NS基因的高表达与白血病发生、发展的关系奠定基础。方法： (1)体外培养HL-60细胞,在对数生长期分别采用终浓度为0.1μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L的ATRA分别作用24h、48h和72h,用RT-PCR技术检测ATRA诱导后NS基因的表达变化,找出ATRA诱导HL-60细胞分化的最佳作用浓度和作用时间,以该作用浓度和作用时间诱导HL-60细胞分化,用RT-PCR技术分别检测NF-κB和Cyclin D1、Cyclin A基因的表达变化。 (2)倒置显微镜下活体观察HL-60细胞诱导前后生长状态的变化,瑞氏.姬姆萨染色观察ATRA诱导前后细胞形态的变化。 (3)流式细胞仪观察ATRA诱导前后细胞粒度、大小以及细胞表面分化抗原的变化。 (4)应用免疫细胞化学技术检测NS、NF-κB、Cyclin A和Cyclin D1蛋白在ATRA诱导分化前后表达水平的变化,从蛋白水平反映NS、NF-κB和CyclinA、D1与诱导白血病细胞重新分化的关系及与NS变化的关联性。 (5)所得结果运用SPSS17.0统计软件进行统计分析,对定量资料,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示；对定性资料采用χ2检验；多样本均数的比较采用方差分析,方差不齐时进行变量转换。以a=0.05为显著性检验标准。 结果： (1)ATRA诱导HL-60细胞分化过程中NS-mRNA表达水平降低,并且存在时间和浓度依赖性,最佳作用浓度和时间分别是1μmol/L和48h,在最佳诱导条件下,HL-60细胞出现以下分化特征： ①倒置显微镜下活体观察细胞生长状态,ATRA诱导后HL-60细胞聚集程度和密度均下降,细胞大小不等,颗粒感明显,碎片增多,部分细胞呈尾形或梭形。 ②瑞氏-姬姆萨染色结果显示ATRA诱导后细胞大小不一,形态不规则,部分细胞核出现一侧扁平或凹陷,染色质致密而浓集,核仁不清或消失。 ③流式细胞仪检测结果显示ATRA诱导后,CD64分化抗原表达率由31.71%降低到12.53%。 (2)诱导分化后NS基因及NS蛋白表达降低的同时NF-κB、Cyclin D1表达降低,mRNA抑制率分别64.62%、77.99%、58.95%,蛋白的抑制率分别为62.42%、59.24%、65.49%。 (3)诱导分化后Cyclin A变化不明显,mRNA抑制率为12.66%,蛋白抑制率为5.33%。 结论： (1)ATRA体外诱导HL-60白血病细胞重新分化的过程中伴随NS表达下降的同时,NF-κB、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达均下调,Cyclin A mRNA和蛋白变化不明显。 (2)ATRA诱导HL-60白血病细胞重新分化的过程中可能存在NS、NF-κB、Cyclin D1的协同作用,能否成立有待进一步研究。