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ICP27特异性siRNA抑制HSV-1病毒复制的实验研究

贾丽洁  
【摘要】: 单纯疱疹病毒性脑炎(Herpes simplex virus encephalitis,HSE)是散发性病毒性脑炎中最常见的类型,其病情严重、发展迅速、病死率高。现有的抗HSV-1药物不能完全抑制和清除潜伏的病毒,且耐药性强。95%的成人HSE由单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1, HSV-1)引起,HSV-1是双链的包膜DNA病毒,按照基因表达的时序性,基因组可分为立即早期基因(immediate-early, IE)、早期基因(early, E)和晚期基因(late, L)。ICP27 (infected cell protein,感染细胞蛋白)为63 KDa的感染细胞蛋白,是HSV-1病毒复制必需的关键激活子,在HSV-1生命周期的IE期产生。ICP27抑制宿主细胞mRNA剪接,补充病毒复制位点的RNAII聚合酶,促进病毒转录体核输出;抑制IE、E基因,活化L基因,促使E基因想L基因表达,刺激病毒转录翻译;同时与抑制Ⅰ型干扰素信号和HSV-1病毒体的合成相关。 RNA干扰是近年来发展起来的转录后基因沉默过程,其作为一种新型基因阻断技术与传统的基因敲除技术以及反义技术相比,具有特异性强、效能高、作用迅速、毒性低、操作简便等优点,已被广泛应用于感染性病毒的基因治疗研究,并取得了令人鼓舞的效果。 本实验通过建立稳定表达ICP27序列特异性siRNA的重组Vero-siRNA细胞系,初步分析抑制ICP27对HSV-1在Vero细胞中复制能力的影响,探索ICP27缺失是否具有阻断HSV-1复制的可能,从而为确定ICP27基因作为HSV-1的抗病毒药物靶点奠定实验基础。 目的: 1建立稳定表达ICP27序列特异性siRNA的重组Vero-siRNA细胞系。 2初步分析ICP27序列特异性siRNA对HSV-1体外复制的抑制作用。 方法: 1以HSV-1 ICP27基因为靶点,设计3对特异性siRNA,退火连接到慢病毒质粒pLKO.1-puro,构建重组pLKO.1-puro-siRNA慢病毒表达载体,利用MluⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。 2利用脂质体2000将pLKO.1-puro-siRNA、Δ8.2、VSV-G三质粒共转染293T细胞得到重组慢病毒。 3重组慢病毒感染Vero细胞,经Puromycin加压筛选,有限稀释后挑取单个细胞克隆扩大培养,即得到重组Vero-siRNA细胞系。 4野生型HSV-1病毒感染重组细胞,利用Realtime PCR和Western blot分别检测各组细胞内ICP27 mRNA和蛋白表达情况。 5用MOI=0.1的野生型HSV-1病毒感染各组细胞,24 h后观察各组细胞病变效应情况,并收集细胞和上清,利用TCID法测定各组病毒滴度。 6采用单因素方差分析(One-way analysis of variance, AN OVA),以α=0.05为检验水准对数据进行统计学分析。 结果: 1 SiRNA退火连接到慢病毒质粒pLKO.1-puro,筛选阳性菌落,经酶切鉴定及测序显示pLKO.1-puro-siRNA构建成功。 2嘌呤霉素加压筛选和有限稀释后成功筛选出ICP27序列特异性siRNA表达阳性的细胞克隆。 3感染HSV-1后,Realtime PCR结果显示重组Vero-siRNA组细胞内ICP27mRNA表达的抑制效率均达85%以上(P 0.001), Western blot证实ICP27蛋白表达也较对照组明显减弱。重组Vero-siRNA细胞系建立成功。 4接种HSV-1后,实验组细胞中细胞病变效应较空白对照组和阴性对照组少40%以上;TCID50结果显示,Vero-siRNA组的病毒滴度比对照组降低约1~2 log10(P0.001),ICP27序列特异性siRNA对HSV-1病毒复制的抑制率均到达80%以上,其中siRNA2抑制效率最高,约为97%。 结论: 1成功建立稳定表达ICP27序列特异性siRNA的重组Vero-siRNA细胞系。 2通过RNAi特异抑制ICP27表达可显著降低HSV-1的体外复制。


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