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肝细胞生长因子在豚鼠透镜诱导性近视形成中的作用

李秀娟  
【摘要】:近视是眼科的常见病、多发病,影响患者的学习、工作和生活,其发病率逐年上升,已经成为严重的医学社会问题。因此,近视的发病机制及其防治已成为全球关注的热点。 随着分子生物学技术的发展,大量研究提示:异常视觉信息引起眼内多种生长因子及神经递质发生改变,通过一系列的信号转导过程,导致巩膜细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过多降解,巩膜重塑,眼轴延长,形成近视。研究证实,近视形成过程中,巩膜基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)表达明显增强。MMP-2是降解巩膜ECM最主要的酶,MMP-2表达增高极可能是近视眼中巩膜重塑的直接原因。但MMP-2表达增高的具体原因尚不清楚。 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种多功能的生长因子,其受体c-Met由原癌基因c-met编码,具有酪氨酸激酶活性。HGF及其受体c-Met存在于多种组织和细胞中。HGF与其受体c-Met结合后,可激活c-Met发生自体磷酸化,启动下游信号转导通路的级联激活,从而调节多种组织器官的生长发育及多种病理过程。近年来大量研究显示,HGF可在多种组织及细胞上调MMP-2的表达,导致ECM降解,发挥其抗纤维化的作用。最近,在小鼠眼球生长基因研究中发现,HGF相关基因可能与眼球生长密切相关。而眼球的生长与近视形成有密切的关系,因此我们推测:HGF可能与近视的形成有关。 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)家族是1990年被发现的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase, MAPK)超家族成员之一,是成纤维细胞等细胞中多种信号从细胞表面向核内传递的共同途径,属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。以JNK为中心的JNK信号转导通路可被生长因子、细胞因子及环境应激等刺激信号激活,从而调控下游基因的转录,在多种疾病的发生发展中起重要的作用。最近研究显示,JNK信号转导通路可介导多种组织及细胞内MMP-2的表达增强,促进ECM降解,发挥抗纤维化等作用。 巩膜组织及细胞中有否HGF及c-Met的表达?近视眼巩膜中HGF及c-Met表达是否增强?HGF能否上调巩膜中MMP-2的表达?如果能,是通过JNK信号转导通路的介导吗?目前国内外文献中尚未见相关报道。 研究建立豚鼠透镜诱导性近视模型,培养豚鼠巩膜成纤维细胞,检测近视形成过程中HGF及MMP-2的表达变化;在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中,观察HGF能否上调MMP-2的表达及JNK信号转导通路在HGF上调MMP-2表达中的作用;玻璃体腔注射JNK信号转导通路的特异性抑制剂SP600125,观察其是否能抑制豚鼠透镜诱导性近视的形成,从而探讨HGF-JNK-MMP-2信号途径在近视形成中的作用,为近视的防治提供新的思路。课题分以下3部分。 第一部分肝细胞生长因子在豚鼠透镜诱导性近视眼的表达 目的 建立豚鼠透镜诱导性近视模型,应用免疫组织化学、Western blot及RT-PCR方法检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met及MMP-2的mRNA及蛋白表达,以探讨HGF与近视形成的关系。 方法 1.动物模型的建立及分组:选用健康1周龄雄性花色豚鼠90只,随机分为正常对照组和透镜诱导组。对照组:30只豚鼠的双眼不作任何处理,共60眼。透镜诱导组:60只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.0D透镜,共60眼。6周后,每组取20眼用于HE染色及免疫组化检测,20眼用于RT-PCR检测,另20眼用于Western blot方法检测。 2.屈光度与眼轴长度测量:实验前后以检影镜检测豚鼠屈光状态,眼科A超测量眼轴长度。 3. HE染色与形态学观察:光学显微镜下观察正常对照组及透镜诱导组的形态学变化。 4.免疫组化染色方法:检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表达。 5.RT-PCR方法:检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met及MMP-2的mRNA表达。 6. Western blot方法:检测正常对照组及透镜诱导组巩膜中HGF、c-Met、p-c-Met及MMP-2的蛋白表达。 7.统计学分析:所有数据均用x±s表示,统计学处理应用SPSS13.0统计软件,2组间比较采用配对t检验,眼轴长度与屈光度关系采用直线相关分析,取α=0.05作为检验水准。 结果 1.屈光度与眼轴长度:与正常对照组比较,透镜诱导组形成了明显近视:负屈光度明显增加(P<0.05),眼轴明显增长(P<0.05)。 2.形态学变化:透镜诱导组视网膜、脉络膜及巩膜均变薄,巩膜胶原纤维变薄、排列稀疏、紊乱。 3.免疫组化染色检测:正常对照组巩膜中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白呈低水平表达,巩膜轻度着染呈淡黄色;透镜诱导组巩膜中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P<0.05),巩膜组织着色呈棕黄色,2组中c-Met蛋白表达比较,差异无统计学意义(P0.05)。 4. RT-PCR方法检测:正常对照组巩膜中可检测到HGF、c-Met及MMP-2mRNA低水平表达;透镜诱导组巩膜中HGF及MMP-2 mRNA表达较正常对照组明显增强(P<0.05),而c-Met mRNA表达在2组中比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 5. Western blot方法检测:正常对照组巩膜中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表达,透镜诱导组巩膜中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P<0.05)。2组中总的c-Met蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05),但在透镜诱导组中p-c-Met蛋白表达明显增强(P<0.05)。 6. HGF. p-c-Met及MMP-2蛋白在透镜诱导组巩膜中表达的相关性分析:在透镜诱导组巩膜中,HGF与p-c-Met, p-c-Met与MMP-2及HGF与MMP-2蛋白表达的相关系数分别是0.902,0.885,0.900,P均<0.05,提示三者的蛋白表达两两相关。 结论 1.透镜诱导组巩膜中,HGF表达增加,其受体c-Met磷酸化增强,提示:HGF可能参与透镜诱导性近视的形成。 2.透镜诱导组巩膜中,HGF、p-c-Met及MMP-2的蛋白表达增强且两两正相关,提示:HGF可能通过上调MMP-2的表达参与透镜诱导性近视形成。 第二部分HGF调控豚鼠巩膜成纤维细胞MMP-2表达的体外研究 目的 实验前期研究发现,HGF可能通过上调MMP-2表达参与透镜诱导性近视的形成和发展。进一步培养正常对照组及透镜诱导组豚鼠巩膜成纤维细胞,在体外检测2组细胞中HGF、c-Met及MMP-2蛋白表达;用HGF及其siRNA处理巩膜成纤维细胞,检测MMP-2的mRNA及蛋白表达;并观察JNK信号转导通路在HGF调控MMP-2表达中的作用。从而探讨HGF-JNK-MMP-2信号途径在近视形成中的作用。 方法 1.培养正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞:将30只1周龄雄性花色豚鼠随机分为正常对照组和透镜诱导组。对照组:10只豚鼠的双眼不作任何处理,共20眼。透镜诱导组:20只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.OD透镜,共20眼。4周后,处死豚鼠,体外培养正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞,观察细胞形态,并鉴定细胞类型。 2.免疫细胞化学染色方法及Western blot方法检测正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表达。 3.探讨在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中,MMP-2是否为HGF的直接靶基因: 3.1 MTT法检测不同浓度(0.1 ng/ml、1ng/ml、10ng/ml)的HGF对正常对照组巩膜成纤维细胞增殖的影响。 3.2上述不同浓度的HGF作用于正常对照组巩膜成纤维细胞,Western blot方法检测细胞中p-c-Met的蛋白表达,RT-PCR及Western blot方法检测MMP-2的mRNA及蛋白表达。选取不明显影响巩膜成纤维细胞增殖、上调MMP-2表达作用明显的HGF的浓度为10ng/ml,用于后续实验。 3.3鉴于透镜诱导组巩膜成纤维细胞中内源性HGF基因表达较高,我们选择其用于HGFsiRNA转染。在透镜诱导组巩膜成纤维细胞中转染HGF siRNA, Western blot方法检测HGF蛋白表达,RT-PCR及Western blot方法检测MMP-2 mRNA及蛋白表达。 4.探讨在体外培养豚鼠巩膜成纤维细胞中,HGF上调MMP-2的表达是否通过JNK信号转导通路介导: 4.1 HGF (10ng/ml)作用于正常对照组巩膜成纤维细胞,Western blot方法检测JNK信号转导通路的状态及MMP-2蛋白表达的变化。 4.2 MTT法检测不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)的SP600125对正常对照组巩膜成纤维细胞增殖的影响,选取10μmol/L为最佳浓度,用于后续实验。 4.3 SP600125 (10μmol/L)预处理后,HGF(10ng/ml)作用于正常对照组巩膜成纤维细胞,Western blot方法检测JNK信号转导通路的状态及MMP-2蛋白表达的变化。 5.统计学分析:所有数据均用x±s表示,统计学处理应用SPSS13.0统计软件,2组间比较采用配对t检验,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,取α=0.05作为检验水准。 结果 1.培养的正常对照组和透镜诱导组巩膜成纤维细胞生长良好,光镜下观察形态差异不明显。2组细胞均表达波形蛋白,而不表达角蛋白,表明所培养细胞确实为成纤维细胞。 2. 2组巩膜成纤维细胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表达: 2.1免疫细胞化学染色方法:正常对照组巩膜成纤维细胞中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表达,胞浆呈淡黄色着色;透镜诱导组巩膜成纤维细胞中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P<0.05),胞浆呈棕黄色着色,2组细胞总c-Met蛋白表达Mol/L(P>0.05)。 2.2 Western blot方法检测:正常对照组巩膜成纤维细胞中可检测到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表达;透镜诱导组巩膜成纤维细胞中HGF、MMP-2蛋白表达较正常对照组明显增强(P<0.05);2组细胞总c-Met蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05),但透镜诱导组巩膜成纤维细胞中c-Met蛋白磷酸化明显增强(P<0.05)。 3.在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中: 3.1不同浓度的HGF(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml)对正常对照组巩膜成纤维细胞干预72h后未见促进或抑制增殖能力的作用,与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05) 3.2在正常对照组巩膜成纤维细胞中,HGF以剂量依赖的方式上调p-c-Met蛋白表达,随后以剂量依赖的方式上调MMP-2的mRNA及蛋白表达,各组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05) 3.3在透镜诱导组巩膜成纤维细胞中转染HGF siRNA, HGF siRNA以时间依赖的方式抑制HGF蛋白表达,与空白对照组比较,72h后HGF蛋白表达明显下降(P<0.05),同时MMP-2的mRNA及蛋白表达也明显下降(P<0.05) 4.在体外培养的豚鼠正常对照组巩膜成纤维细胞中: 4.1 HGF (10ng/ml)可以激活细胞中JNK信号转导通路,诱导JNK磷酸化增强,继而引起MMP-2蛋白表达明显上调(P<0.05)。 4.2不同浓度的SP600125干预细胞72h后,未表现出明显促进或抑制增殖能力的作用,与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 4.3用SP600125(10μmol/L)预处理细胞后,HGF(10ng/ml)作用引起的JNK磷酸化和MMP-2蛋白表达上调均被明显抑制(P<0.05)。 结论 1.透镜诱导导致豚鼠巩膜成纤维细胞内新的HGF蛋白合成以及MMP-2蛋白表达上调。 2.在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中,HGF上调MMP-2的表达。 3.在体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞中,HGF上调MMP-2的表达是通过JNK信号转导通路来实现的。提示,HGF可能通过HGF-JNK-MMP-2信号途径参与豚鼠透镜诱导性近视形成。 第三部分:SP600125阻断豚鼠透镜诱导性近视巩膜中JNK信号转导通路的研究 目的 为了进一步在体内探讨近视巩膜中SP600125对JNK信号转导通路及近视形成的抑制作用,研究首先建立豚鼠透镜诱导性近视模型,采用玻璃体腔注射给药的方式,进一步明确JNK信号转导通路在近视形成中的作用及SP600125对近视的抑制作用。 方法 1.动物模型的建立与分组:选用健康1周龄雄性花色豚鼠70只,随机分成4组:Ⅰ组(透镜诱导6周组)、Ⅱ组.(透镜诱导6周+PBS组)、Ⅲ组(透镜诱导6周+SP600125(10μmol/L)组)、Ⅳ组(正常对照组)。正常对照组10只豚鼠,取双眼20眼为实验眼;余每组20只豚鼠,均以右眼为实验眼。 2.屈光度及眼轴长度测量:同第1部分 3. HE染色与形态学观察:同第2部分 4. Western blot方法:检测各组豚鼠巩膜组织中p-JNK和MMP-2的蛋白表达。 5.统计学分析:同第1部分 结果 1.屈光度及眼轴长度:Ⅰ组形成明显的高度近视,负屈光度及眼轴长度均较Ⅳ组明显增加(P均<0.05),Ⅲ组能部分抑制上述改变,而Ⅱ组则无明显抑制作用。表明,SP600125(10μmol/L)部分抑制异常视觉信号引起的近视形成。 2. HE染色与形态学观察:Ⅰ组与Ⅳ组比较,后极部巩膜明显变薄,Ⅲ组能部分抑制上述巩膜的改变,而Ⅱ组则无明显抑制作用。 3. Western blot方法检测:Ⅰ组巩膜组织p-JNK及MMP-2的蛋白表达较Ⅳ组明显增强(P<0.05),Ⅲ组能部分抑制上述改变,而Ⅱ组则无明显抑制作用。表明,SP600125部分抑制了异常视觉信号引起的p-JNK及MMP-2的蛋白表达。 结论 JNK信号转导通路的抑制剂SP600125可能具有抑制近视的作用。


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