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循环BRAF突变基因联合其它检测在甲状腺乳头状癌诊断及预后作用的实验研究

刘方舟  
【摘要】:目的: 探讨BRAF基因突变、RET基因重排发生情况及CK1、HBME-1、Galectin-3、E-cadherin蛋白在中国人甲状腺乳头状癌表达及临床病理相关性。研究其分子生物学改变与临床病理学特征及诊断、预后间的关系。为其分子诊断、判断预后及靶基因治疗提供实验依据。采用循环核酸检测BRAF突变基因为甲状腺乳头状癌诊断及预后寻找一种特异的检测技术。 方法: 第一部分 90例甲状腺肿瘤组织、血浆的核酸抽提,其中包括15例结节性甲状腺肿合并乳头状增生,10例甲状腺腺瘤,5例滤泡性甲状腺癌和60例甲状腺乳头状癌患者。进行循环及组织BRAF突变基因的扩增和测序鉴定,对循环及组织突变阳性和阴性的病人的临床病理特点进行分析。 第二部分 236例甲状腺乳头状癌组织、癌旁正常组织核酸的抽提及逆转录合成cDNA。进行BRAF突变基因扩增和测序鉴定。进行RET重排方式RET/PTC1、RET/PTC3的扩增和测序鉴定,综合分析RET重排、BRAF突变在甲状腺乳头状癌的发生情况及其与临床病理的相关性和生物学意义。 第三部分 269例甲状腺组织、包括10例结节性甲状腺肿合并乳头状增生,10例甲状腺腺瘤,8例滤泡性甲状腺癌,5例正常甲状腺组织,236例甲状腺乳头状癌组织。按阵列设计顺序放入受体蜡块中,应用免疫组织化学技术(SP法)测定CK19、HBME-1、Galectin-3、及E-cadherin的表达。与甲状腺乳头状癌BRAF基因突变表达进行对照,探讨它们是否可以作为甲状腺肿瘤特异性的分子标记物,分析它们在甲状腺肿瘤诊断中的特异性、敏感性和准确性以及联合检测是否更有助于肿瘤良、恶性的鉴别诊断。 第四部分 收集江苏省肿瘤医院1980年1月-2009年12月30年来收治并有完整随访资料的石蜡包埋甲状腺乳头状癌1286病例进行分析,所有病例均有两名病理学教授按照WHO分类标准进行形态学观察。分析相关因素与其预后关系。 结果: 第一部分 在60例乳头状癌中有26例检测到BRAFT1799A基因的突变,突变阳性率为43.3%,在22例乳头状癌中有9例检测到循环BRAFT1799A阳性(9/22、40.91%),突变位点位于第15外显子的1799位点,所有突变均为杂合性突变,在其余病例中均未发现有突变。甲状腺乳头状癌患者血浆中突变BRAFT1799A与组织标本基因突变有相关性,与肿瘤分期和肿瘤大小有相关性。BRAF基因突变与患者的性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移无相关性。 第二部分 在236例乳头状甲状腺癌组织中,发现了64例(27.12%)RET基因重排,包括55例RET/PTC 1(23.31%)和9例RET/PTC3(3.81%),癌旁正常甲状腺组织、非乳头状甲状腺癌肿瘤组织未发现RET重排。无RET/PTC1、RET/PTC3同时表达。RET重排在年龄≤20岁、20-40岁和≥40岁三组中的概率分别为:57.78%、22.0%和16.48%,年龄≤20岁的群体RET重排的概率最高。RET/PTC1阳性的病例更容易在良性甲状腺疾病的基础上伴随甲状腺乳头状癌;RET/PTC3阳性的病例具有高的甲状腺外侵犯的特点,相对分期也较晚。103例发现了BRAFT1799 A(43.64%),在BRAF突变阳性的病人中,20例(8.47%)同时检测出了一种以上的重排,多重分子改变群体比单种分子病理改变和没有分子病理改变的病人发病年龄要轻。在年龄≥60岁的病人中,BRAF突变是唯一检测出的分子改变(80.65%)。基因重排和BRAF突变的发生率随着年龄的增大而减少。通过多因素的回归分析,BRAF突变,RET重排,男性,年龄,多灶性和晚期的T分类是甲状腺乳头状癌颈侧区(Ⅱ-Ⅴ区)淋巴结转移的高危因素。 第三部分 1.组织芯片制备结果 按课题需要制作12×15芯片6张,组织点阵排列整齐,无点阵移位现象,有7个位点缺失,其他位点组织均可见有意义的肿瘤组织结构。组织位点的形态可观测率在99.352%。HE染色及免疫组织化学染色均匀,无脱片、异位和皱折。 2免疫组织化学检测结果 2.1 CK19在甲状腺不同病变中的表达 检测到甲状腺腺瘤中1例,结节性甲状腺肿伴乳头状增生中3例,甲状腺乳头状癌231例阳性表达。甲状腺腺瘤组和结节性甲状腺肿伴乳头状增生组分别和甲状腺乳头状癌组比较均存在显著性差异(P0.05)。其鉴别诊断的灵敏度、特异度和准确度分别为97.88%、80.0%、96.48%。 2.2 HBME-1在甲状腺不同病变中的表达 检测到HBME-1蛋白在甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿伴假乳头增生及甲状腺乳头状癌组织中阳性率分别为10.0%、10.0%和86.4%,三者之间存在显著性差异(P0.05)。在甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿伴乳头状增生中仅有2例弱阳性表达,甲状腺乳头状癌中87例强阳性表达,HBME-1在甲状腺乳头状癌和甲状腺良性病变鉴别诊断中的灵敏度为86.44%,特异度为90.0%,准确度为86.71%。 2.3Galectin-3在甲状腺不同病变中的表达 检测到Galectin-3蛋白在2例甲状腺腺瘤,3例结节性甲状腺肿伴乳头状增生,226例甲状腺乳头状癌组织中的表达。结果显示Galectin-3在乳头状癌组织中的表达(95.76%)明显高于腺瘤(20.0%)和结节性甲状腺肿伴乳头状增生组(30.0%)。甲状腺腺瘤组和结节性甲状腺肿伴乳头状增生组分别和甲状腺乳头状癌组比较均存在显著性差异(P0.05)。Galectin-3在甲状腺乳头状癌和甲状腺良性病变鉴别诊断中的95.76%,特异度为80.0%,准确度为94.53%。 2.4 E-cadherin在甲状腺不同病变中的表达 检测到E-cadherin蛋白在甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿伴乳头状增生病变中E-cadherin强阳性表达,阳性率分别为90.0%和80.0%,在甲状腺乳头状癌中只有部分细胞表达且表达强度较弱,阳性率仅为16.95%。三组之间存在显著性差异(P0.05)。其鉴别诊断的灵敏度、特异度和准确度分别为83.05%、85.0%、83.2%。 3. CK19、HBME-1、Galectin-3及E-cadherin四种蛋白的相关性分析显示甲状腺乳头状癌中四种蛋白的表达彼此之间均无明显相关性。 4.甲状腺乳头状癌中CK19、HBME-1、Galectin-3及E-cadherin表达与年龄、性别、肿瘤大小均无明显相关性。甲状腺乳头状癌伴淋巴结转移Galectin-3蛋白阳性表达阳性率高于无淋巴结转移者。E-cadherin蛋白在有甲状腺乳头状癌腺体外侵犯及淋巴结转移病例表达低于无腺体外侵犯及淋巴结转移病例。 5.甲状腺乳头状癌中CK19、HBME-1、Galectin-3及E-cadherin四种蛋白表达与BRAFT1799A突变关系无明显相关性。 第四部分 本组中位随访年龄为9年。全组总的5、10、15、20年生存率分别为95.87%、92.04%、87.33%、82.13%。单因素分析显示:性别、有无淋巴结及远处转移、肿瘤大小、年龄、肿瘤侵犯情况、手术切除情况、临床分期与预后有关。多因素分析显示:性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤侵犯程度、分期、淋巴结转移、远处转移是影响预后的重要因素。 结论: 第一部分: 甲状腺乳头状癌患者血浆中突变BRAFT1799A与组织标本BRAFT1799A突变有相关性,和肿瘤分期和肿瘤大小也有相关性。BRAF基因突变与患者的性别、组织学类型、淋巴结转移无相关性(P0.05)。 第二部分 本研究中中国人甲状腺乳头状癌存在RET/PTC1和RET/PTC3两种重排方式,在年龄≤20岁的病人群体,RET重排的概率是50%,明显高于其它的年龄群体;RET重排同乳头状甲状腺癌Ⅱ-Ⅴ区淋巴结密切相关,RET/PTC、男性、发病年龄早、多发病灶、晚期的T分类被证实为甲状腺乳头状癌侧颈部淋巴结转移的高危险因素,应当对RET/PTC阳性甲状腺乳头状癌的病人的侧颈部进行更详细的术前评估和术后随访。推测RET/PTC 1可能在甲状腺乳头状癌与甲状腺炎的相关性方面具有一定的作用。RET重排,BRAF突变等多重分子病理改变容易在年轻的病人中发生。联合检测RET/PTC重排、BRAF突变和其他的涉及甲状腺乳头状癌分子改变的危险因素,将会提高分子标记作为一种诊断指标和靶向治疗指标的预测意义。 第三部分 1.CK19的灵敏度是97.88%,故CK19是鉴别甲状腺良性病变与甲状腺乳头状癌的最灵敏的标记物。 2. HBME-1的特异度为90.0%,所以HBME-1是鉴别甲状腺良性病变和甲状腺乳头状癌的最特异的标记物。 3.CK19的准确度为96.48%,CK19是四个指标中鉴别甲状腺良性病变与甲状腺乳头状癌的最准确的标记物。 4.联合检测四个指标中的任意两个,特异度都有所升高,但灵敏度稍有下降,联合检测Galectin-3和CK19的灵敏度为96.82%,特异度为80.0%,准确度为95.51%。比其他几个组合准确度高,比单个指标鉴别诊断的准确度也高,联合检测两个指标更有助于甲状腺良性病变与甲状腺乳头状癌的鉴别诊断。 5.联合检测四个指标中的任意三个指标,其特异度都是100%,但灵敏度降低,准确度也降低,联合检测Galectin-3、HBME-1和CK19灵敏度和准确度最高分别为66.7%和88.5%,联合检测三个指标并不一定有利于甲状腺癌的鉴别诊断。 6. CK19、HBME-1、Galectin-3及E-cadherin四种蛋白的异常表达在甲状腺乳头状癌的发生发展过程中可能并无明显的协同作用。 7. CK19、BME-1、Galectin-3及E-cadherin四种蛋白的表达与BRAFT1799A突变无明显相关性(P0.05)。联合分析第二部分BRAFT1799A突变测定结果和甲状腺乳头状癌各临床病理因素,可以预测甲状腺乳头状癌病人预后。 8.可联合测定Galectin-3、E-cadherin蛋白表达判定有无腺体外侵犯及淋巴结转移。 9.组织芯片手工制做,程序简单、经济方便,是一种简便可行,高效稳定的技术方法,能满足相关科研课题和实际工作的需要。 第四部分 性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结及远处转移是影响甲状腺乳头状癌预后的重要因素。PI值可作为甲状腺乳头状癌患者预后的估计。


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