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布—加综合征下腔静脉病变隔膜形态学和相关基因筛选研究

党晓卫  
【摘要】:布-加综合征(Budd Chiari syndrome, B-CS)的病因和发生机制目前尚不明确。各国学者从不同的角度开展研究,出现了“先天发育畸形学说”、“血栓形成学说”、“机械损伤学说”和“感染学说”等多种病因学说理论。随着对病因研究的深入,人们逐渐发现B-CS的发生和发展是一个多因素参与的复杂过程。目前一般认为B-CS发病与地域关系密切,西方国家大多数与有明确病因的凝血机制异常相关(继发性B-CS),而在我国多为原发性B-CS,可能与性别、年龄、居住的环境、劳动强度、生活状况、卫生条件、肝脏功能以及基因突变等都有关系。由于B-CS病变隔膜不易获得,国内外对B-CS的病因学研究多集中在凝血机制异常和单个基因突变方面,而对病变隔膜的来源、形成、发生和发展等方面认识有限。 本课题通过大体观察B-CS患者下腔静脉病变隔膜特征,利用光镜、电镜对比观察病变隔膜与成熟皮肤瘢痕组织(以下简称瘢痕组织)、正常下腔静脉壁的组织结构异同,并进行免疫组织化学检查,观察病变隔膜组织中的化学变化、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)、平滑肌细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达和细胞凋亡情况。同时应用基因芯片筛选出B-CS下腔静脉病变隔膜和正常下腔静脉壁中差异表达的基因,并初步探讨其基因表达谱差异表达基因与病变隔膜形成关系。从形态学、细胞因子、细胞凋亡和基因表达角度探讨B-CS的发病机制,为进一步深入研究布-加综合征的发病机制提供依据并奠定分子生物学基础。 论文共分2部分: 第一部分布-加综合征下腔静脉病变隔膜形态学研究 方法 肉眼观察2007年10月-2009年12月根治性切除手术切除的11例B-CS下腔静脉病变隔膜形态特征,利用光镜、电镜对比观察病变隔膜与10例瘢痕组织、12例正常肝后段下腔静脉壁的组织结构异同,同时进行免疫组织化学检查,研究病变隔膜中组织学变化、FGFR、PCNA和凋亡细胞的表达情况,并与瘢痕组织和正常下腔静脉壁对照。 结果 1大体观察 1.1手术中见病变隔膜位于下腔静脉入右心房3.0cm范围内,其中6例在2.0cm处。隔膜呈白色,边缘较厚,中央偏薄,表面与IVC内膜相连。8例呈现横行分布,3例斜行分布。9例切除时隔膜与血管壁分离较易,切除隔膜后创面基本光滑,2例不易分离,行锐性切除,创面粗糙。9例隔膜下方IVC有附壁血栓。5例病变隔膜局部有钙化。术后用水冲洗后见病变隔膜白色,外表光滑,隔膜边缘厚度5.0mm-9.0mm,平均(6.8±1.5)mm,中央厚度3.0mm-6.0mm,平均(4.6±1.0)mm。 1.2瘢痕组织呈灰白色半透明状,表面平整光滑,质地较硬,略高出皮肤,手术切除后见瘢痕组织波及皮肤全层。 1.3正常下腔静脉血管内膜呈白色,1例发现Eustachian瓣。 2光镜下组织形态学观察 2.1病变隔膜组织由粗大的均质胶原纤维及成纤维细胞构成,胶原排列紊乱,部分胶原纤维呈透明变性。其中微血管较少,大部分呈闭合状态。隔膜边缘为不等程度的纤维结缔组织增生、平滑肌细胞增生和透明样变性,9例伴有附壁血栓;8例透明样变性;5例有组织钙化;7例有炎细胞浸润,以淋巴细胞浸润为主,另有浆细胞和嗜酸性粒细胞浸润,少量单核细胞和中性细胞浸润;偶可见肉芽组织和新生血管等病理改变。 2.2瘢痕组织:真皮层变薄,少量散的纤维细胞和大量的胶原纤维,胶原纤维平行或交错分布,并相互融合,形成粗大的胶原纤维束。小血管稀少,其间可见炎性细胞浸润。未见毛囊和汗腺等皮肤附属器结构。 2.3可见下腔静脉壁的内膜、中膜和外膜三层结构,管腔面为一层完整的内皮细胞覆盖,内皮细胞呈扁平圆形,单层排列整齐,细胞间结合紧密,胞核呈椭圆形。内皮下平滑肌层较厚,细胞多为梭形,肌细胞之间有少量细胞间质为胶原纤维和少量弹力纤维,中、外膜分界不明显。 3 FGFR、PCNA表达和AC情况 病变隔膜、瘢痕组织和正常下腔静脉(壁)中均有FGFR及PCNA阳性细胞。三种组织中FGFR的阳性表达率分别为17.30±1.54、18.50±1.64和8.80±1.24; PCNA在上述三中组织中阳性表达率分别为40.76±3.67、38.46±2.33和22.10±2.01。病变隔膜组和瘢痕组间FGFR和PCNA相比差异无统计学意义(P均0.05);病变隔膜组和正常下腔静脉组相比FGFR和PCNA阳性表达均增高(P均0.05)。 凋亡细胞数在病变隔膜中的表达与瘢痕组织中差异无统计学意义(P0.05),但在两者中的表达均低于在正常下腔静脉(壁)中的凋亡细胞数(P0.05)。 4电镜观察(超微结构) 4.1病变隔膜组织中可见较多的纤维细胞,表面有少量内皮细胞,呈扁平状,核形状不规则。内皮细胞内线粒体大部分嵴和膜脱落融合、模糊不清或缺失,粗面内质网轻度扩张,可见颗粒融合和脱颗粒现象。内膜部分脱落或断裂,向管腔内突起。偶见凋亡细胞,但体积缩小。 4.2瘢痕组织中成纤维细胞周围分布大量胶原纤维,胶原纤维排列紊乱,成纤维细胞呈梭状,细胞表面有粗大的突起,核大而呈椭圆,核仁明显,胞浆内可见粗面内质网;核蛋白体丰富,线粒体多,为椭圆形或圆形;胞膜内侧可见大量的分泌小泡。 4.3正常下腔静脉壁内膜平整,内皮细胞扁平圆形,排列规则,呈条带状分布,与血管长轴方向一致,细胞间结合紧密。血管内皮细胞为单层扁平上皮细胞,多数内皮细胞未见细胞核。内皮细胞内可见线粒体、粗面内质网及吞饮小泡,内皮细胞下为少量排列较稀疏的胶原纤维及弹性纤维。内皮下平滑肌层较厚,平滑肌细胞排列整齐,细胞核梭形,细胞质内见较多的肌丝及少量线粒体、粗面内质网。外膜见有胶原纤维、脂肪细胞及毛细血管。 第二部分布-加综合征下腔静脉病变隔膜相关基因筛选 方法 取3例手术切除新鲜冻存的B-CS下腔静脉病变隔膜和3例正常肝后段下腔静脉壁(入右心房口下方),提取总的RNA,鉴定其质量,使用Agilent荧光标记,经基因芯片进行杂交,杂交后的芯片用激光扫描仪进行扫描,用软件提取和分析数据,用t检验筛选病变隔膜和正常下腔静脉壁组织中的差异表达的基因(以P0.05和FC10为条件),并用相关软件预测可能的靶基因谱。 结果 病变隔膜与正常下腔静脉壁组织中的差异表达的基因有9371个,其中4986个在病变隔膜基因表达谱中出现上调,4385个出现下调。一些文献中报道与B-CS病变隔膜形成相关的一些基因如FVL、JAK2-V617F和G20210A等均有表达。 结论 1 B-CS下腔静脉病变隔膜形成以纤维细胞增生为主,损伤和炎症反应参与了隔膜形成过程; 2 FGFR、PCNA和细胞凋亡可能参与了B-CS下腔静脉病变隔膜的形成,它们表达程度的高低与病变隔膜发展及转归相关; 3基因芯片技术能有效分析出B-CS下腔静脉病变隔膜的相关基因表达谱,利用软件预测出差异表达的可能靶基因,这些基因的异常表达可能参与了病变隔膜的形成。


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