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内质网应激诱导肝癌细胞对阿霉素耐药的机制

翟文龙  
【摘要】:背景与目的 肝癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率及死亡率均较高。在我国,多数肝癌患者就诊时已属中晚期,丧失了手术机会,化疗成为肝癌治疗的重要手段。阿霉素是治疗肝癌的一线化疗药物,但疗效并不理想,肝癌细胞的对阿霉素的耐药现象则是导致其治疗失败的主要原因。深入探讨肝癌细胞对阿霉素产生耐药的机制十分必要。为此,国内外学者从不同角度探讨了肝癌多药耐药机制,但对内质网应激与肝癌耐药的关系甚少述及。 本课题拟分三个部分从组织及细胞水平揭示内质网应激诱导肝癌细胞耐药的机制,为完善肝癌细胞耐药机制注入新的内容,为肝癌治疗提供新的思路。 第一部分:肝癌组织中内质网应激与PI3K/Akt通路的关系 方法 收集肝癌组织标本30例,正常肝组织标本28例,采用免疫组织化学技术检测Bip及p-Akt的表达情况;取肝癌组织及正常肝组织标本各5例,采用Western blot技术检测各组织中Bip及p-Akt的表达情况。 结果 免疫组化结果及Western blot结果均显示:肝癌组织内Bip表达量及Akt磷酸化水平均明显高于正常肝组织(P0.05);且肝癌组织内Akt的磷酸化水平与Bip的表达量呈显著正相关。 第二部分:探讨内质网应激与肝癌细胞对阿霉素耐药的关系 第一阶段:建立肝癌细胞内质网应激模型 方法 用5μg/ml的衣霉素分别处理SMMC7721及HepG2肝癌细胞,于处理后0h、2h、12h及24h,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western blot技术检测衣霉素诱导肝癌细胞内Bip在蛋白水平的表达情况;RT-PCR技术比较衣霉素处理肝癌细胞Oh及2h时Bip在mRNA水平的表达及内XBP1mRNA的剪接情况。 结果 1与0 h相比,衣霉素处理SMMC7721及HepG2肝癌细胞2 h、12 h及24 h后,Bip在蛋白水平的表达量均明显提高(P0.05)。 2与对照组相比,衣霉素处理SMMC7721及HepG2肝癌细胞2 h后,Bip mRNA表达量均明显提高(P0.05)。 3与对照组相比,衣霉素处理SMMC7721及HepG2肝癌细胞2 h后,XBP1mRNA的剪接产物XBP1s mRNA水平均明显提高(P0.05)。 第二个阶段:明确内质网应激能否诱导肝癌细胞对阿霉素耐药 方法 贴壁培养肝癌细胞SMMC7721及HepG2并分四组:未加药对照组、衣霉素处理组及阿霉素处理组及衣霉素+阿霉素处理组,采用-MTT法及流式细胞仪技术检测各组细胞生长抑制的率及凋亡率。 结果 1衣霉素处理组、阿霉素处理组及衣霉素加阿霉素处理组SMMC7721细胞相对生长抑制率分别为:15.1%±0.7%、57.3%±1.5%及36.7%±2.1%。与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率明显下降(P0.05)。 2对照组、衣霉素处理组、阿霉素处理组及衣霉素加阿霉素处理组的SMMC7721细胞凋亡率分别为2.1%±0.5%、13.2%±1.6%、47.6%±2.4%及29.8%±2.0%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P0.05);与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞凋亡率明显下降(P0.05)。 3衣霉素处理组、阿霉素处理组及衣霉素加阿霉素处理组的HepG2细胞相对生长抑制率分别为16.2%±0.4%、54.9%±2.1%及30.8%±1.4%;与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率明显下降(P0.05)。 4对照组、衣霉素处理组、阿霉素处理组及衣霉素加阿霉素处理组的HepG2细胞凋亡率分别为1.9%±0.8%、11.7%±1.1%、42.1%±2.9%及26.9%±1.8%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P0.05);与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞凋亡率明显下降(P0.05)。 第三部分:探讨PI3K/Akt通路在内质网应激诱导肝癌细胞对阿霉素产生耐药中的作用 第一阶段:明确内质网应激与PI3K/Akt的关系 方法 用5μg/ml的衣霉素分别处理SMMC7721及HepG2肝癌细胞,于处理后0h、2h、12h及24h,收集细胞,提取细胞总蛋白,Western blot技术检测衣霉素各组肝癌细胞内Akt磷酸化水平及蛋白表达水平。 结果 与0h相比,衣霉素处理SMMC7721及HepG2肝癌细胞2h、12 h及24 h后, Akt磷酸化水平明显提高(P0.05),但Akt的蛋白表达水平无明显变化(P0.05)。 第二阶段:探讨PI3K/Akt通路在内质网应激诱导肝癌细胞耐药中的作用 方法 将SMMC7721肝癌细胞分三组:未加药对照组、衣霉素处理组及PI3K抑制剂(LY294002或Wortmannin)+衣霉素处理组,Western blot技术检测各组肝癌细胞内Akt的磷酸化水平。另将SMMC7721肝癌细胞分四组:未加药对照组、阿霉素处理组、衣霉素+阿霉素处理组及PI3K抑制剂(LY294002或Wortmannin)+衣霉素+阿霉素处理组,采用MTT法及流式细胞仪技术检测各组细胞生长抑制的率及凋亡率。 结果 1与对照组相比,衣霉素处理组及LY294002(Wortmannin)+衣霉素处理组的Akt表达量无明显变化(P0.05);与对照组相比,衣霉素处理组及LY294002(Wortmannin)+衣霉素处理组Akt的磷酸化水平明显提高(P0.05)。 2阿霉素处理组、衣霉素加阿霉素处理组及LY 294002+衣霉素+阿霉素处理组SMMC7721细胞相对生长抑制率分别为58.1%±1.6%、36.8%±1.4%及46.0%±1.6%。与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率明显下降(P0.05);与衣霉素加阿霉素处理组相比,LY294002+衣霉素+阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率明显提高(P0.05);LY 294002+衣霉素+阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率仍低于阿霉素处理组(P0.05)。 3对照组、阿霉素处理组、衣霉素加阿霉素处理组及LY 294002+衣霉素+阿霉素处理组SMMC7721细胞凋亡率分别为2.7%±0.7%、50.3%±3.0%、28.5%±1.9%及35.4%±2.3%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P0.05);与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞凋亡率明显下降(P0.05);与衣霉素加阿霉素处理组相比,LY 294002+衣霉素+阿霉素处理组的细胞凋亡率明显提高(P0.05);LY 294002+衣霉素+阿霉素处理组的细胞凋亡率仍低于阿霉素处理组(P0.05)。提示PI3K抑制剂LY 294002可部分逆转内质网应激诱导肝癌细胞SMMC7721对阿霉素的耐药现象。 4阿霉素处理组、衣霉素加阿霉素处理组及Wortmannin+衣霉素+阿霉素处理组SMMC7721细胞相对生长抑制率分别为58.5%±1.6%、37.2%±0.6%及46.4%±0.7%。与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率明显下降(P0.05);与衣霉素加阿霉素处理组相比,Wortmannin+衣霉素+阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率明显提高(P0.05);Wortmannin+衣霉素+阿霉素处理组的细胞相对生长抑制率仍低于阿霉素处理组(P0.05)。 5对照组、阿霉素处理组、衣霉素加阿霉素处理组及Wortmannin+衣霉素+阿霉素处理组SMMC7721细胞凋亡率分别为2.2%±0.6%、48.1%±2.7%、27.3%±1.8%及37.6%±1.9%。与对照组相比,各药物处理组细胞凋亡率均明显增高(P0.05);与阿霉素处理组相比,衣霉素加阿霉素处理组的细胞凋亡率明显下降(P0.05);与衣霉素加阿霉素处理组相比,Wortmannin+衣霉素+阿霉素处理组的细胞凋亡率明显提高(P0.05);Wortmannin+衣霉素+阿霉素处理组的细胞凋亡率仍低于阿霉素处理组(P0.05)。 结论 1.肝癌组织内存在内质网应激, Akt通路亦被激活,且二者之间关系密切。 2.内质网应激参与诱导肝癌细胞对化疗药物阿霉素产生耐药; 3. PI3K/Akt通路的激活参与了内质网应激诱导肝癌细胞对阿霉素产生耐药;阻断PI3K/Akt通路可部分逆转内质网应激诱导肝癌细胞对阿霉素产生耐药的现象。


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