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MicroRNA相关单核苷酸多态性与原发性肝癌遗传易感性研究

李玉春  
【摘要】:原发性肝癌是世界范围内的常见恶性肿瘤之一,其发病原因不仅与环境暴露因素有关,同时个体的遗传易感性也在其中起到了重要作用。近几年来,科研人员发现了一种新的基因表达调控机制,即microRNA介导的转录后调控。该调控机制的核心内容是microRNA种子区与相关基因mRNA上靶序列的Waston-Crick碱基配对识别,该种识别能够引起:mRNA全部或者部分的翻译抑制。MicroRNA调控网路中的SNPs主要包括以下三个部分:调控microRNA成熟的通路基因SNPs、microRNA基因自身的SNPs以及microRNA靶序列SNPs。 MicroRNA调控网络中的SNPs可以影响成熟microRNA的表达水平、结构及其与靶基因的识别等方面,这种microRNA调控网络中发生的异常,最终能够影响目的基因的表达和功能实现,从而改变个体的肿瘤易感性。在总结相关生物信息学资料的基础上,结合中国人群特点,本研究选取了12个microRNA调控网路中的SNPs,通过频数匹配的病例对照研究,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和等位基因特异PCR (AS-PCR)技术对这12个多态性位点进行检测,比较基因型频率在原发性肝癌患者和正常对照之间的分布差异,探讨影响河南汉族人群原发性肝癌发病的基因型、单体型以及基因-环境交互作用项,从而为原发性肝癌病因学研究和个体化防治提供思路。 目的 1.研究调控nicroRNA成熟的通路基因标签SNPs,具体包括DICER1基因rs3742330,RAN基因rs14035和rs3803012,GEMIN4基因rs7813、rs1045491、 rs2291778、rs2740348和rs3744741位点及其与原发性肝癌遗传易感性的关联,并推测其可能的作用机制。 2.研究microRNA前体SNPs,具体包括pre-miR-146a rs2910164和pre-miR-196a2rs11614913位点及其与原发性肝癌遗传易感性的关联,并推测其可能的作用机制。 3.研究microRNA靶序列SNPs,具体包括IL16基因rs1131445位点和NOD2基因rs3135500位点及其与原发性肝癌遗传易感性的关联,并推测其可能的作用机制。 4.对上述SNPs进行部分和整体联合分析,探讨影响原发性肝癌发病的基因型、单体型以及基因-环境交互作用。方法 调控nicroRNA成熟的通路基因标签SNPs的选取:由HapMap (http//www.hapmap.org)数据库获得中国人群(CHB) DICER1、RAN及GEMIN4基因的SNPs信息,将数据导入Haploview4.2软件运行,按照如下标准选取标签SNPs:r20.8,最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)设置为0.05。采用连锁不平衡值(D’值)置信区间法,将D’值95%CI在0.70~0.98的相邻SNP归入同一个单体型块。从DICER1基因中筛选出1个标签SNPs rs3742330位点;从RAN基因中筛选出2个标签SNPs,分别为rs14035和rs3803012位点;从GEMIN4基因中筛选出5个标签SNPs,分别为rs7813,rs1045491,rs2291778,rs2740348和rs3744741位点。 MicroRNA前体SNPs的选取:pre-miR-146a rs2910164及pre-miR-196a2rs11614913主要通过文献回顾选取。MicroRNA靶序列SNPs内选取:首先通过文献回顾,总结肝癌特征所涉及到的96个易感基因,然后在NCBI数据库中下载96个基因3’非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)的SNPs,利用miRanda、 PicTar、TargetScans和RNAfold webserver网站预测这些SNPs的microRNA靶标和自由能,以与“种子”序列严格碱基互补配对的位点作为候选microRNA靶位点,最终在这些基因里找到10个SNPs存在于潜在的miRNA靶位点中,挑选与肝癌关系密切,MAF0.05且结合自由能值(ΔΔG)相对较大的2个位点进行实验验证,分别是ILl6基因的rs1131445和NOD2基因的rs3135500位点。 采用频数匹配的病例对照研究方法选取河南汉族560例原发性肝癌患者和560例正常对照,分别采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和等位基因特异PCR(AS-PCR)技术对上述12个多态性位点进行基因分型检测。采用用χ2验比较原发性肝癌患者和正常对照之间的一般人口学特征。采用非条件Logistic回归比较各基因型在原发性肝癌患者和正常对照之间分布频率的差异。采用Haploview4.2软件进行单体型预测。采用χ2检验比较单体型在两组分布的差异。采用趋势χ2检验分析突变位点数量与原发性肝癌发病风险之间的剂量反应关系。采用多因素降维法(multifactor dimensionality reduction, MDR)和多因素Logistic回归分析基因-环境的交互作用。 结果 单位点分析结果显示,RAN基因rs14035TT基因型携带者原发性肝癌的发病风险是CC基因型携带者的2.40倍(OR=2.40,95%CI:1.11-5.18); GEMIN4基因rs1045491A等位基因携带者原发性肝癌的发病风险是G等位基因携带者的1.66倍(OR=166,95%CI:1.29-2.13),rs2291778T等位基因携带者原发性肝癌的发病风险是G等位基因携带者的0.71倍(OR=0.71,95%CI:0.60-0.85); pre-miR-146a rs2910164位点G等位基因携带者原发性肝癌的发病风险是C等位基因携带者的1.33倍(OR=1.33,95%CI:1.12-1.57);IL16基因的rs1131445位点CC基因型携带者原发性肝癌的发病风险是TT基因型携带者的0.64倍(OR=0.64,95%CI:0.52-0.93)。DICER1基因rs3742330位点,RAN基因rs3803012位点,GEMIN4基因rs7813位点、rs2740348位点、rs3744741位点,pre-miR-196a2rs11614913位点,NOD2基因rs3135500位点各基因型在病例组和对照组中分布无统计学差异(P0.05)。 应用Haploview4.2软件对调控microRNA成熟的通路基因中8个标签SNPs进行单体型分析,结果表明单体型AATCAGGT和单体型AGTCAGCC可分别增加原发性肝癌发病风险(OR=1.37,95%CI:1.08-1.74; OR=1.32,95%CI:1.01-1.72),而单体型AATCGTCC和单体型AACCGTGT可分别降低原发性肝癌发病风险(OR=0.71,95%CI:0.55-0.93; OR=0.62,95%CI:0.41-0.82)。采用MDR软件分析基因-环境交互作用,结果表明具有rs14035(等位基因T)和rs1045491(等位基因A)和饮酒史交互组合的“高危”人群原发性肝癌的发病风险是非上述组合“低危”人群的3.48倍(OR=3.48,95%CI:2.38-5.56)。 应用Haploview4.2软件对microRNA调控网络的12个SNPs综合分析表明单体型AGTTAGGTCGGC可增加原发性肝癌发病风险(OR=2.29,95%CI:1.08-4.83),而单体型AACTGTGCTGCC可降低原发性肝癌发病风险(OR=0.62,95%CI:0.40-0.98)。采用MDR软件分析基因-环境交互作用,结果表明具有rs14035(等位基因T)和rs2910164(等位基因G)和饮酒史交互组合的“高危”人群原发性肝癌的发病风险是非上述组合“低危”人群的3.66倍(OR=3.66,95%CI:2.19-4.40)。 结论 RAN基因、GEMIN4基因、pre-miR-146a、LI6丛因可能与河南汉族人群原发性肝癌的发生有关,其中RAN基因的rs14035位点TT基因型、GEMIN4基因rs1045491位点A等位基因、pre-miR-146a rs2910164位点G等位基因能增加原发性肝癌的发病风险;GEMIN4基因rs2291778位点T等位基因、IL16基因rs1131445位点CC基因型能降低原发性肝癌的发病风险。针对调控microRNA成熟的通路基因8个标签SNPs分析表明:单体型AATCAGGT和单体型AGTCAGCC是河南汉族人群原发性肝癌的遗传危险因素,单体型AATCGTCC和单体型AACCGTGT是河南汉族人群原发性肝癌的遗传保护因素,rs14035(等位基因T)和rs1045491(等位基因A)和饮酒史交互作用项是原发性肝癌的危险交互作用项。针对microRNA调控网络的12个SNPs综合分析表明:单体型AGTTAGGTCGGC是河南汉族人群原发性肝癌的遗传危险因素,单体型AACTGTGCTGCC是河南汉族人群原发性肝癌的遗传保护因素,rs14035(等位基因T)和rs2910164(等位基因G)和饮酒史交互作用项是原发性肝癌的危险交互作用项。研究结果为进一步认识河南汉族人群原发性肝癌遗传易感性的基因型、单体型以及基因-环境因素交互作用提供了依据。


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