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人NK/T细胞淋巴瘤吉西他滨耐药细胞株的建立和差异基因表达检测

陈新峰  
【摘要】:背景 恶性淋巴瘤(Malignant Lymphoma, ML)是起源于人类免疫系统细胞及其前体细胞的恶性增生性疾病。根据临床病理类型可以分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)。在恶性肿瘤中,我国ML发病率呈逐年上升趋势,非霍奇金淋巴瘤是目前发病率增长最快的肿瘤,其发病率居全世界第五(女性)或第六(男性)位。已成为严重威胁着人类健康和生命的一种疾病。 在中国从2000年1月到2008年12月6382例淋巴瘤患者被收集,其中成熟B细胞型占56%,成熟T细胞型和NK细胞型占26%,前驱恶性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤约占5%-13%。排前六的淋巴瘤中NK/T细胞淋巴瘤仅次于弥漫大B细胞淋巴瘤位于第二,同世界其他地区相比,亚洲尤其是中国发病率高,同其他报道相似。NK/T细胞淋巴瘤(Natural Killer/T cell lymphoma)是非霍奇金淋巴瘤的一个亚型,发病率居T细胞淋巴瘤的首位,中国发病率远高于西方国家。该病具有起病隐匿、早期诊断困难、高度侵袭性、进展速度快、生存期短、预后较差等特点,早期采用放化疗,中晚期主要是采用化疗为主的综合治疗。目前国际上对于NK/T细胞淋巴瘤尚无标准的治疗方案,因此寻找高效低毒且不易产生耐药的化疗药物势在必行。大量的临床研究证明,以吉西他滨为主的化疗方案对非霍奇金淋巴瘤的疗效确切。同时我们的前期研究通过常规化疗药物敏感试验发现NK/T淋巴瘤细胞株SNK-6、YTS对吉西他滨高度敏感,吉西他滨有可能成为有效治疗NK/T细胞淋巴瘤的药物,但NK/T细胞淋巴瘤细胞对化疗药物多药耐药是影响化疗疗效的主要因素,NK/T细胞淋巴瘤患者原发或继发耐药一直困扰着临床医生,于是本课题选择采用体外药物浓度梯度递增法建立NK/T细胞淋巴瘤吉西他滨耐药细胞株YTS-Gem,为进一步研究NK/T细胞淋巴瘤的发生发展和耐药产生机制提供了理想的模型,同时本课题发现的基因表达差异,为NK/T细胞淋巴瘤的基础和临床研究提供了重要的研究线索。 目的 建立人NK/T细胞淋巴瘤细胞株(YTS)吉西他滨(Gemcitabine, Gem)耐药细胞株(YTS-Gem),研究其生物学特性,检测YTS和YTS-Gem的基因表达差异,探讨NK/T细胞淋巴瘤耐药机制。 方法 应用体外细胞培养技术对YTS细胞进行体外培养,采用吉西他滨体外浓度梯度递增法建立可以稳定传代的YTS-Gem.光镜观察形态学变化、MTT法分析耐药指数、绘制生长曲线、计算倍增时间以及流式细胞仪分析YTS、YTS-Gem的细胞周期分布及表面标记物;采用荧光实时定量PCR (Real-time PCR)检测细胞周期相关基因Caspase,细胞凋亡相关基因p53、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体基因(TRAIL)和髓样细胞白血病-1基因(Mcl-1),合成、修复和重组相关基因核糖核苷酸还原酶亚单位M1和M2(RRM1和RRM2),细胞代谢相关基因脱氧胞苷激酶(dCK)和脱氧胞苷脱氨酶dCDA,耐药相关基因多药耐药基因1(mdr-1)、肺耐药基因(LRP)和多药耐药相关基因(MRP),比较上述基因在YTS和YTS-Gem内基因表达差异。 结果 1成功建立了人NK/T细胞淋巴瘤耐药细胞株YTS-Gem, YTS-Gem与YTS同源。 2与YTS相比,具有不同的生物学特性:YTS和YTS-Gem对吉西他滨的IC50值分别为0.049μg/mL和1.960μg/mL,耐药指数达到了40;与YTS相比生长速度变慢,倍增时间分别为41.36h和51.17h;与YTS相比,YTS-GemGO/G1期细胞比例减少、S期细胞比例增多、G2/M期细胞无明显变化,组间比较差异有统计学意义(P0.01)。 3Real-time PCR检测结果显示:Mcl-1、p53、MRP、dCDA、RRM1及RRM2在YTS-Gem的表达明显升高(P0.05), dCK、Caspase、TRAIL在YTS-Gem的表达明显降低(P0.05),而ndr-1、LRP在YTS及YTS-Gem中表达无明显差异(P0.05) 结论 1成功建立了人NK/T细胞淋巴瘤耐药细胞株YTS-Gem。 2YTS-Gem具有不同于正常NK/T细胞淋巴瘤细胞株YTS的生物学特征,两者之间有广泛的差异表达基因,包括细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因、合成和修复相关基因、细胞代谢相关基因以及耐药相关基因。


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