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CYP3A4*1G多态性对芬太尼体外代谢影响

侯军凯  
【摘要】:【背景与目的】 芬太尼在我国临床麻醉、自控镇痛等方面应用非常广泛,是阿片受体激动剂,属于强效麻醉性镇痛药。临床研究发现芬太尼镇痛效应以及不良反应存在明显的个体差异。国内外研究证实芬太尼主要在肝脏内代谢,细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)3A4作为芬太尼的代谢酶,其活性具有明显的个体差异。芬太尼的代谢会受到CYP3A4转录表达以及酶的活性差异等直接影响。本课题组前期进行相关研究,结果显示CYP3A4*1G突变可影响芬太尼体内代谢及术后芬太尼需要量的改变。但是国内外不同的研究表明CYP3A4*1G对CYP3A4酶及芬太尼需要量的影响相互矛盾。目前发现的CYP3A4单核苷酸多态性(SNPs)约40个,CYP3A4*1G的突变频率最高。针对日本人群的大规模测序发现CYP3A4*1G突变频率为24.9%,在中国人群中突变率约为26%。CYP3A4*1G对芬太尼体外代谢的影响尚不明确。本研究旨在研究芬太尼的体外肝微粒体代谢以及CYP3A4*1G对芬太尼体外代谢的影响,以利于尽可能摒除对其影响的其他繁杂干扰因素,从而在遗传学上探讨对芬太尼代谢产生明显个体差异的因素,为促进芬太尼的个体化应用提供参考。 【材料与方法】 1.研究对象 本研究进行人体组织实验已获得郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。88例人体肝脏组织取自郑州大学第一附属医院肝胆外科行肝脏部分切除手术的患者。患者年龄20~65岁,并已排除糖尿病、肾脏病、肝功能异常、急慢性肝炎、肝硬化、长期吸烟酗酒史,并排除术前1个月内应用过对肝CYP3A4酶有诱导或抑制作用的食物或药物的患者。于术中手术切除组织外缘取直径1cm的正常肝组织(经本院病理形态学证实),30min内置入液氮冷冻并保存。 2.基因多态性检测 抽取外周静脉血2ml,采用酚-氯仿法提取基因组DNA;通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism,PCR-RFLP)技术进行CYP3A4*1G基因型检测,同时进行PCR扩增产物基因测序验证基因分型方法的可靠性。根据CYP3A4*1G基因型检测结果将患者分为CYP3A4*1/*1(野生纯合子)、CYP3A4*1/*1G(突变型杂合子)和CYP3A4*1G/*1G(突变型纯合子)三组。 3.肝脏微粒体制备 采用钙沉淀法制备肝微粒体,将微粒体蛋白悬浮于0.25M的蔗糖溶液中,分装,于-80℃下保存备用。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。 4.芬太尼的体外代谢 采用体外肝微粒体孵育体系,以芬太尼为代谢底物,分别孵育0min,5min,10min,15min,20min后终止反应并萃取,流动相复溶后进样。芬太尼底物浓度采用高效液相色谱法(HPLC)进行检测。 5. CYP3A4mRNA水平的测定 采用Trizol法抽提总RNA,使用紫外分光光度计检测样品,以A260nm/A280nm比值测定RNA浓度。逆转录合成cDNA后采用Real-Time PCR技术对模板进行相对定量。 6..统计学分析 数据分析采用SPSS17.0软件,计量资料以x±s表示,以χ2检验检测等位基因和基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;χ2检验或Fisher’s精确概率检验比较不同种族间等位基因的发生频率;多组间数据进行单因素方差分析(ANOVA),各组比较采用LSD法。突变等位基因数量与芬太尼代谢速率之间的相关性采用等级相关分析,计量资料变量之间的关系采用直线相关分析。检验水准为α=0.05。 【结果】 1.肝胆外科患者CYP3A4*1G等位基因频率 88例所采集肝标本的肝胆外科患者中,59例为野生纯合子组(CYP3A4*1/*1),25例为突变杂合子组(CYP3A4*1/*1G),4例为突变纯合子组(CYP3A4*1G/*1G)。CYP3A4*1G等位基因突变率为18.8%。CYP3A4*1G等位基因的野生型纯合子、突变型纯合子、杂合子的分布符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05),表明本研究人群CYP3A4*1G基因型分布已达到遗传平衡,具有群体代表性。 2.芬太尼代谢速率的测定 前期实验中取30例患者(男12例女18例)肝组织提取微粒体进行芬太尼体外代谢,经分析测定芬太尼在国人体外肝微粒体中平均每毫克蛋白的芬太尼代谢速率为1.64±0.77nmol min-1,最低为0.31nmol min-1,最高为2.84nmol min-1,个体差异明显。 3. CYP3A4*1G基因多态性对芬太尼代谢速率的影响 23例野生型个体、22例突变型杂合子个体和4例突变型纯合子个体芬太尼的代谢速率分别为1.89±0.58nmol min-1mg-1protein、1.82±0.65nmol min-1mg-1protein和0.85±0.37nmol min-1mg-1protein。使用多组定量资料比较得到三组患者肝微粒体体外芬太尼代谢速率差异有统计学意义(P0.05),CYP3A4*1G/*1G组较CYP3A4*1/*1G组和CYP3A4*1/*1组低,且差异具有统计学意义(P0.05),CYP3A4*1/*1G组和CYP3A4*1/*1组相比差异无统计学意义(P0.05)。 4.不同性别对芬太尼在体外代谢速率的影响 49例测定芬太尼体外肝微粒体代谢的患者肝组织按照性别分组,女性组22例,男性组27例。女性组平均年龄51.73±9.13岁,男性组平均年龄50.41±11.20岁,年龄差异无统计学意义(P0.05)。使用两独立样本t检验比较得到两组患者肝微粒体体外芬太尼代谢速率差异无统计学意义(P0.05)。 5.不同年龄对芬太尼在体外代谢速率的影响 49例测定芬太尼体外肝微粒体代谢的患者平均年龄50.98±10.24岁。采用Spearman秩相关进行相关性分析,研究发现不同年龄和芬太尼体外肝微粒体代谢速率不存在相关性(P0.05)。 6.不同肝胆病变对芬太尼在体外代谢速率的影响 49例测定芬太尼体外肝微粒体代谢的患者肝组织按照不同肝胆病变分组,肝血管瘤组20例,肝癌组12例,胆组织病变组17例。使用多组定量资料比较得到三组患者肝微粒体体外芬太尼代谢速率差异无统计学意义(P0.05)。 7. Real time PCR测定CYP3A4的mRNA水平 成功测定36例患者肝标本中mRNA含量,其中CYP3A4*1/*1组23例,CYP3A4*1/*1G组11例,CYP3A4*1G/*1G组2例。结果显示,患者肝组织中mRNA含量个体差异明显,最高水平为19.11,最低水平为0.11。CYP3A4*1/*1组平均水平为6.49,CYP3A4*1/*1G组平均水平为3.28,CYP3A4*1G/*1G组平均水平为1.20,且三组患者肝组织mRNA水平相比差异均有统计学意义(P0.05)。 8. CYP3A4mRNA水平与芬太尼在体外肝微粒体中代谢的相关性 同时检测17例样本CYP3A4mRNA水平及芬太尼在体外肝微粒体中代谢的测定,发现CYP3A4mRNA的表达量和芬太尼在体外肝微粒体中代谢速率存在正相关(P0.01)。 【结论】 1. CYP3A4*1G突变对肝微粒体中细胞色素P4503A4酶代谢芬太尼具有显著影响,突变型纯合子降低了芬太尼代谢速率。这可能是引起临床上芬太尼药效学个体差异的主要原因; 2.不同性别、年龄及不同肝胆疾病对肝微粒体中细胞色素P4503A4酶代谢芬太尼没有显著影响。可能不是引起临床上芬太尼药效学个体差异的主要原因; 3. CYP3A4mRNA的表达量与CYP3A4酶代谢芬太尼速率呈正相关关系。


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