MiR-146b-5p对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1相关生物学特性的影响研究

【摘要】：背景Micro RNAs(小分子RNA,mi RNAs)是一类全长约为21~25个核苷酸的非编码单链小RNA分子,mi RNA可以识别特定的靶m RNA,转录以后信使RNA可以调节基因的表达水平,从而参与调控细胞的生长、增殖、分化、凋亡等生命活动。内分泌系统最常见的恶性肿瘤为甲状腺癌,其在恶性肿瘤中约占3%,已跃居头颈部恶性肿瘤的首位,女性发病较多。近年来各国报道甲状腺癌发病率的增长多以PTC为主。由于PTC早期多无明显症状,常常导致患者就诊时已经有淋巴结转移或已侵犯周围器官和组织。因此,探索PTC有效的治疗靶点、寻找更安全有效的治疗途径一直是提高PTC生存率和生存质量所亟待解决的难题。在本实验前期的研究中,应用高通量的Micro RNA微阵列筛选不同分期的PTC组织和癌旁正常组织中差异表达的Micro RNA时发现,mi R-146b-5p在早期和中晚期PTC组织中均呈明显高表达,同时随着肿瘤分期的增加,其表达水平有升高的趋势,提示其在PTC发生、发展和转移过程中起着重要作用。Mi R-146b位于10q24.32,与mi R-146a具有高度的序列同源性。He及Sheu等通过基因芯片技术及RT-PCR方法研究发现mi R-146b在PTC组织中过表达。Kim、Xing及Chou等发现mi R-146b在BRAF基因突变组织中表达明显升高,BRAF基因突变与PTC的侵袭性有关,这可能是mi R-146b在PTC中过表达的一个分子机制。但目前尚未有关于mi RNA-146b-5p与PTC细胞生物学影响及相关机制的相关报道,通过本课题的研究,可望获得mi R-146b-5p对PTC的生物学行为影响的可靠证据,为确立mi R-146b-5p作为PTC诊断和预后监测的生物学指标及治疗靶点奠定理论基础。本次实验通过对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1细胞株稳定转染使mi R-146b-5p过表达,之后通过CCK-8、划痕实验、transwell小室侵袭实验以及流式细胞仪检测对比转染前后PTC的增殖、凋亡、周期以及迁移、侵袭能力的变化。从而探讨mi R-146b-5p过表达与甲状腺乳头状癌发展的关系及mi R-146b-5p在甲状腺乳头状癌中的作用机制。目的本实验通过慢病毒载体构建和慢病毒包装并通过慢病毒侵染试验,使得hsa-mir-146b-5p在甲状腺乳头状癌细胞TPC-1细胞株中得到稳定高表达,这个试验为接下来进一步研究mi R-146b-5p过表达对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学特性的影响打下坚实的基础。方法1.慢性毒质粒的构建:(1)构建mi R-146b-5p过表达慢病毒质粒(2)将过表达慢病毒质粒转染人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1,获取mi R-146b-5p稳定过表达的细胞单克隆2.mi R-146b-5p对甲状腺乳头状癌细胞生物学行为的影响(1)观察mi R-146b-5p过表达对TPC-1细胞增殖的影响:cck-8法检测mi R-146b-5p过表达后可以明显促进TPC-1细胞的增殖,实验组和对照组的细胞数均有增加,但实验组的细胞增殖更加明显(P0.05)。(2)分析mi R-146b-5p过表达对TPC-1细胞周期和凋亡的影响:通过流式细胞仪分析技术,可以看到实验组和对照组的细胞凋亡率之间有明显差异,实验组细胞凋亡率减少更为明显。(3)研究mi R-146b-5 p过表达对TPC-1细胞迁移能力的影响:划痕实验观察过表过mi R-146b-5p的细胞,细胞迁移能力明显增强,transwell小室侵袭实验观察细胞的侵袭能力明显增强。结果(1)经慢病毒包装侵染将mi R-146b-5p转染至甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中,细胞数都有所增加,但转染组的TPC-1细胞增殖的更加明显。(P0.05)。(2)CCK-8法和流式细胞仪技术检测转染mi R-146b-5p基因后可以明显促进甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的增殖,实验组和对照组的TPC-1细胞数都有所增加,但实验组的TPC-1细胞数增加更加显著。(P0.05)。(3)流式细胞仪技术检测细胞凋亡率:实验组和空载组、对照组相比较细胞凋亡减少明显,差异显著。(P0.05)。(4)划痕实验观察转染mi R-146b-5p后稳定转染mi R-146b-5p中,24h、48h、72h迁移细胞数量均高于空载体组和对照组,转染mi R-146b-5p后TPC-1细胞的迁移细胞明显增加(P0.05)。transwell小室侵袭实验观察24h、48h、72h的穿膜细胞数,转染mi R-146b-5p后TPC-1细胞的穿膜细胞数明显增多(P0.05)。结论经过慢病毒稳定转染mi R-146b-5p后,转染后细胞经过CCK-8、划痕实验、以及流式细胞仪技术检测:TPC-1细胞的增殖得到促进,凋亡减少,迁移、侵袭能力明显增强。提示在TPC-1细胞中mi R-146b-5p与甲状腺乳头状癌的发展相关,mi R-146b-5p的过表达可以促进TPC-1细胞的异常增殖,这种作用可能是mi R-146b-5p通过调控某种抑制基因靶蛋白来实现的,抑制基因尚有待于进一步分析和研究。