正常人肝微粒体CYP3A4/5药物代谢活性的个体差异

【摘要】：CYP3A是细胞色素P450(CYP)家族中的主要成员,同属CYP3A家族重要成员且同源性较高的CYP3A4、CYP3A5在肝脏表达非常丰富,参与许多外源性(药物、环境毒物/致癌物)和内源性物质(固醇类激素)的代谢。由于CYP3A4/5代谢活性个体差异很大,许多研究针对CYP3A4/5活性个体差异的原因进行了探讨。早期研究主要将活性的个体差异归因于基因多态性和环境因素,随着研究进一步深入,研究者认识到表观遗传甚至蛋白间的相互作用也是引起CYP3A4/5活性个体差异的原因。CYP3A4/5的立体结构灵活多变,可参与许多物质的代谢。由于底物的多样性,因此CYP3A4/5对一种底物的代谢活性并不一定能够反映其对另一种底物的代谢活性。鉴于此,美国FDA推荐探究CYP3A4/5活性时需使用两种探针药物(咪达唑仑和睾酮)。但至今未见采用大样本的正常人肝微粒体研究CYP3A4/5代谢咪达唑仑和睾酮的酶动力学间的相关性,并且大多数代谢活性的研究是在人体内和重组酶系统中展开的,前者不能单一反映出CYP3A4/5的代谢过程,后者与人体内环境有一定的差异。因此,人肝微粒体是与人体最接近的体外代谢研究平台。本研究拟以105例正常人肝微粒体为研究对象,以咪达唑仑和睾酮为探针底物,分别探讨并比较CYP3A4/5对两种探针底物代谢活性的个体差异,分别考察并比较基因多态性、人口学因素、环境因素、蛋白相互作用对CYP3A4/5代谢两种探针底物活性的影响,同时分析了CYP3A4/5对两种探针底物代谢活性的相关性。通过本研究,以期阐明CYP3A4/5对不同底物代谢活性存在较大个体差异的原因,为临床合理应用经CYP3A4/5代谢的药物提供有价值的理论依据。方法1肝脏标本的收集收集肝功能正常的肝血管瘤患者肝标本105例,标本均来自郑州大学第一附属医院和河南省人民医院。其中男性37例,女性68例,年龄为20-75岁,用药史显示,手术近期没有服用能够显著影响CYP酶活性的药物。2人肝微粒体的制备采用差速离心法制备人肝微粒体,并且用Bradford法测定人肝微粒体的蛋白浓度。3人肝微粒体代谢咪达唑仑和睾酮的酶动力学首先确定最佳孵育条件(合适的微粒体蛋白浓度和最佳孵育时间)。其次进行肝微粒体体外温孵实验,选取咪达唑仑和睾酮为CYP3A4\5底物,配制人肝微粒体孵育体系(探针底物、磷酸盐缓冲液及水),预孵育后,加入NADPH启动反应,蛋白沉淀终止反应后离心取上清,HPLC法检测代谢产物浓度。4 CYP3A4/5和CYP2D6的基因分型采用基因组柱式提取试剂盒从肝组织中提取全基因组DNA,设计CYP3A4/5及CYP2D6特异性引物,用特定引物扩增出含有突变位点的片段,经测序确定其基因型。5统计方法使用Graph Pad Prism 5.0求得每例标本的酶动力学参数,使用SPSS17.0统计软件进行相关数据的统计分析。结果1人肝微粒体代谢咪达唑仑和睾酮的酶动力学分别以咪达唑仑和睾酮为底物。人肝微粒体中CYP3A4/5代谢咪达唑仑的酶动力学参数Km、Vmax和CLint的中位数分别为:1.85μM、789.60pmol·min-1·mg-1protein、464.60μL·min-1·mg-1protein,范围分别为0.44~10.20μM、69.40~5035.00pmol·min-1mg-1 protein及8.27~1673.53μL·min-1·mg-1 protein,Km、Vmax和CLint差异倍数分别为23.18、72.55和202.36倍。人肝微粒体中CYP3A4/5代谢睾酮的酶动力学参数Km、Vmax和CLint的中位数分别为:41.46μM、4785.50pmol·min-1·mg-1protein、107.09μL·min-1·mg-1protein,范围分别为22.19~152.50μM、265.60~10679.00pmol·min-1mg-1protein及1.74~278.09μL·min-1·mg-1protein,Km、Vmax和CLint差异倍数分别为6.87、40.21和159.82倍。2咪达唑仑和睾酮酶动力学参数的相关性采用Spearman检验对咪达唑仑和睾酮的酶动力学参数进行相关性分析,CYP3A4/5对咪达唑仑和睾酮代谢的Vmax呈现出强相关性(r=0.643),CLint呈现出弱相关性(r=0.245),Km不存在相关性。3基因多态性对CYP3A4/5代谢咪达唑仑和睾酮的影响3.1 CYP3A4/5的基因多态性对酶动力学参数的影响结果显示,CYP3A4 20230 GA位点突变会增加咪达唑仑的Km和Vmax,对睾酮代谢没有影响。CYP3A5 6986AG位点突变会降低咪达唑仑的Km和Vmax,也会降低睾酮的Vmax,而CYP3A4 20070TC的基因多态性对两种底物的酶动力学参数均无影响。3.2 CYP2D6的基因多态性对酶动力学参数的影响结果显示,CYP2D6 1661GC基因多态性可影响咪达唑仑的Km,与GC基因型相比,CC基因型代谢咪达唑仑的Km降低,但对CLint和Vmax无影响。CYP2D6 1661GC基因多态性对睾酮的酶动力学参数无影响。CYP2D6 100CT基因多态性可影响睾酮的Vmax,与CC基因型相比,CT基因型的Vmax升高,但对Km和CLint无影响。CYP2D6 100CT基因多态性对咪达唑仑的酶动力学参数均无影响。统计分析的结果表明,吸烟、饮酒、性别和年龄对人肝微粒体CYP3A4/5代谢咪达唑仑和睾酮的酶动力学参数均无显著的影响。4吸烟、饮酒、性别和年龄对CYP3A4/5代谢咪达唑仑和睾酮的影响结论1.人肝微粒体CYP3A4/5对咪达唑仑和睾酮的代谢活性存在显著的个体差异。2.人肝微粒体CYP3A4/5对咪达唑仑和睾酮代谢的Vmax呈现出强相关性(r=0.643),CLint呈现出弱相关性(r=0.245),Km不存在相关性。3.CYP3A4 20230 GA位点的突变显著增加CYP3A4/5代谢咪达唑仑的Km和Vmax,对睾酮代谢无影响。4.CYP3A5 6986AG位点的突变显著降低CYP3A4/5代谢咪达唑仑的Km和Vmax,显著降低CYP3A4/5代谢睾酮的Vmax。