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D-二聚体胶体金免疫层析法定量检测方法的建立

崔宁  
【摘要】:背景D-二聚体(D-Dimer,D-D)是交联纤维蛋白(Fb)经纤溶酶作用后的特异降解产物,可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物,是唯一反映凝血和纤溶的理想指标。当患有血栓性及肺栓塞性疾病、弥散性血管内凝血(DIC)、心脑血管疾病、肝脏疾病及肿瘤性疾病时,体内D-二聚体含量会明显升高,尤其在肺栓塞和深静脉血栓的排除诊断中,D-二聚体的含量具有极其重要的临床排除诊断价值。此外,D-二聚体的升高与急性胰腺炎、糖尿病血管性病变及急慢性荨麻疹等疾病的发生发展和预后有极其密切的联系。因此,检测样本血浆中D-二聚体的含量对于多种疾病的辅助诊断和预后监测具有极其重要的临床意义。目前,检测D-二聚体的方法主要有乳胶凝集法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫比浊法和胶体金免疫层析法,目前临床上应用最多的是免疫比浊法。然而,免疫比浊法虽有定量准确、灵敏度高、试剂重复性好、稳定性好等优点,但其需要大型仪器设备,从而限制了D-二聚体检测项目在基层医院的普及开展。这就使得在D-二聚体的检测中,急需要一种快速、简便同时可定量的检测方法以普及D-二聚体的检测,而胶体金免疫层析定量检测技术正具有了上述优点,进而弥补了免疫比浊法的不足。近年来,随着胶体金免疫层析技术的不断发展和成熟,胶体金免疫层析技术也已从定性发展为既可定性又可定量,并越来越广泛地应用于多种物质的检测,也以其独特的优势有望应用于D-二聚体的定量检测中。目的建立一种灵敏度高、特异性强、精密性好、稳定性优、线性范围宽的D-二聚体胶体金免疫层析定量检测方法,为D-二聚体的检测提供了一种新的技术和方法,为临床辅助诊断相应疾病提供更便捷的实用价值。方法本课题应用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金溶液,应用尿激酶裂解纤维蛋白的方法制备室内参考品,运用河南省生物工程技术研究中心金标实验技术和平台对本课题多种实验条件进行了优化和选择,对试纸条的灵敏度、特异性、线性、精密性和稳定性等方面进行了评价,并将本课题建立的检测方法与美国IL公司的ACL-TOP700检测系统(免疫比浊法)进行了对比。结果研究结果显示,本课题制得的D-二聚体室内参考品在-20℃条件下可以保存至少7个月,4℃条件下可以保存至少3个月,37℃条件下可以保存至少7天,达到了室内质控品的要求;本检测方法的最低检测限为0.15625ug/ml,线性范围为0.15625-10ug/ml;与纤维蛋白原、甘油三酯及胆红素均无交叉反应性;批内变异系数分别为3.78%和2.81%,批间变异系数分别为4.95%和4.07%;在4~25℃储存条件下截止目前存放了12个月,37℃条件下放置144h,试纸条性能未见下降;用本课题建立的检测方法与美国IL公司的ACL-TOP700检测系统(免疫比浊法)对55份临床样本中的D-二聚体含量进行测定,两种结果相关系数R2=0.98593,回归方程Y=0.95964X+0.02645,两者相关性良好。结论(1)制备出稳定的D-二聚体室内参考品,可成功用于D-二聚体胶体金免疫层析定量检测方法的建立;(2)成功建立D-二聚体胶体金免疫层析定量检测方法的标准曲线;(3)初步建立了D-二聚体胶体金免疫层析定量检测方法。


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