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miR-144靶向细胞周期蛋白B1抑制肝癌增殖、迁移和侵袭的初步研究

谷军生  
【摘要】:研究背景:全球预计有20亿人目前或曾经感染过乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV),约2.4亿人是慢性HBV表面抗原携带者。预计全球每年有65万人死于慢性乙肝并发症,约13万人死于急性肝炎。整体上,HBV感染占据了大约45%的肝癌病例,占据约30%的肝硬化病例。肝癌在男性人群死亡的原因中排名前三,尤其是东南亚地区。根据肝脏肿瘤的病理表现和分子特征,肝脏肿瘤主要分为以下三种:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝胆管型肝癌(cholangiocarcinoma,CCA)、恶性血管内皮细胞瘤(malignant angioendothelioma)。其中最常见的是肝细胞肝癌,肝细胞肝癌的发病率在全世界恶性肿瘤中居第五位,在所有肝脏肿瘤所占比例中高达90%。肝癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,是危害人类健康的重大疾病。肝细胞肝癌手术后发生转移和复发的比例非常高,所以导致肝癌患者总体临床预后较差。肝细胞肝癌的发病机制目前尚未完全明确,针对肝癌的靶向治疗手段依然缺乏。对于肝细胞肝癌患者,肝癌根治性切除术是早期肝癌的主要治疗手段,但是5年内仍会有超过50%的肝癌患者术后发生转移和复发。近年来国际上靶向肝癌的最有效的靶向治疗药物—索拉非尼(sorafenib)给肝癌领域带来新的希望,但是其治疗效果差强人意,同时它们除了对癌细胞起作用外也对正常细胞产生副作用,所以目前肝癌的治疗仍然面临巨大的挑战。随着科学技术的发展以及二代测序技术的兴起,对肝癌基因和蛋白分子水平的深入研究结果表明:很多基因和蛋白与肝癌的分期、复发和转移的恶性特征密切相关,而这些基因和蛋白在肝细胞肝癌的形成和进展过程中发挥了重要的功能,有可能成为未来肝癌精准治疗基因或蛋白的分子靶点。因此,研究肝癌细胞增殖和肝癌转移的分子机制,找到能够在早期准确预测肝癌发生、转移和预后的诊断标志物,采取及时有效的预防和治疗措施,对肝细胞肝癌患者的综合治疗有着重要的意义。细胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)是一种细胞结构蛋白,是成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的伴侣分子。CCNB1的含量在整个细胞周期中呈周期性变化,主要出现在S期开始表达,晚期在细胞质中合成,在G1期表达量达到顶峰,在细胞核膜破裂之前CCDB1被输入到核内,在G2/M时达到峰值,然后迅速被泛素化降解(Ubation),到有丝分裂中期向后期转换时消失。在M中期,MPF活性达到最高,CCNB1和泛素结合后会立即被蛋白酶体(proteasome)识别并胞内降解,从而导致成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)失活,细胞周期M期结束。正常细胞内存在许多细胞周期调控相关蛋白,以维持其基因组完整性和稳定性。但细胞周期调控失衡,会导致肿瘤基因表达异常,继而导致肿瘤细胞增殖及凋亡调控失衡,导致肿瘤的发生。细胞周期蛋白B1是一些原癌基因的产物,因此CCNB1蛋白有可能成为肿瘤潜在的新的治疗靶点,但是CCNB1和肝癌的相关研究目前较少。目前研究已经证实CCNBl在许多肿瘤组织中表达异常。CCNBl通常是过表达的且异常定位于细胞质而非胞核:有研究发现抑制CCNBl向胞质的转运可以诱导凋亡,同时证实细胞周期蛋白B1的表达失衡和肿瘤细胞的形成和发展关系十分密切,并且大量研究证实CCNB1具有的抗凋亡作用机制在肿瘤形成发展过程中也起到了重要作用。大量研究已经证实CCNBl高表达和非小细胞肺癌、食道鳞癌等多种肿瘤的临床预后密切相关;还有学者利用基因微阵列技术发现通过检测CCNB1基因在肿瘤组织中的表达水平可以预测肿瘤的恶性临床表型(转移、复发,化疗耐药性、生存预后),可以为临床的诊断和治疗提供预测的功能。深入的机制研究发现:CCNB1在肿瘤细胞和组织中的异常表达可以导致成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)磷酸化调节机制失衡,所以通过下调CCNBl的表达继而抑制MPF的功能,能够阻止或者干扰肿瘤细胞越过G/M检验点进行细胞分裂增殖,可能是一种潜在的靶向治疗肿瘤的方法。靶向CCNB1也成为靶向肿瘤治疗的一个富有前景的方向。目前直接靶向CCNBl的临床研究还处于起步研究和探索阶段,依然存在很多问题,例如抗CCNBl药物的肿瘤组织靶向问题及其毒副作用,所以通过寻找CCNBl信号转导通路调节通路上关键的基因或者蛋白,对CCNBl信号转导通路调控通路进行更深入的研究,寻找新型的肿瘤治疗靶点,是肿瘤治疗的潜在方向,所以通过靶向CCNBl信号转导通路可能成为抗肿瘤研究领域中具有临床应用前景的方向。micro RNA(即miRNA)是内源性非编码的小RNA的一种,人类基因组内含有的micro RNA就有上千个,每一个micro RNA可以直接调控的靶基因约两百个,而且人体中有将近33%的蛋白编码基因都会受到micro RNA的控制,通过这些数据可以发现,micro RNA在人类基因表达中有着非常重要的地位。近年研究发现约50%已知的miRNAs与多种人类肿瘤相关,表明其在肿瘤发生中具有重要作用。从已证实功能的miRNA来看,它们实际上可作为致癌基因或抑癌基因而发挥作用,同时Micro RNA分子在转录后水平对于基因的调控是现在研究的热点之一。近年来对相关micro RNAs的研究结果提示miRNA在肝细胞肝癌的疾病发生发展过程中发挥了至关重要的调节作用。大量研究证实micro RNAs通过其特有的调节机制,参与了肝癌形成、发展,以及肝癌细胞的分化、增殖凋亡、侵袭和转移等几乎所有的重要生理过程。而大量的大样本测序数据实验结果表明miRNA在肝癌组织或者血清中的表达差异与肝癌恶性临床表型(转移、复发,化疗耐药性、生存预后)密切相关。micro RNA在肝癌的临床诊治和预后中都有着显著作用,但就目前的研究情况来看,关于micro RNA的表达水平研究较多,关于核苷酸序列是否会发生突变的研究较少,核苷酸序列的变化会对micro RNA的功能造成影响,有可能会诱发肝癌,因此应注重对micro RNA序列中碱基突变情况的检测。除此之外,目前的研究中主要关注micro RNA对mRNA的调控,而忽视了micro RNA自身表达可能会受到哪些调控。在肝癌的诊断方面,由于有较多的micro RNA表达会发生变化,可以作为诊断肝癌的micro RNA较多,需要在大样本中验证micro RNA的特异性和敏感度,从而选择准确率和稳定性都较高的micro RNA作为诊断标准,准确指导预后,也是未来需要重点研究的对象以上这些研究结果说明miRNA不仅仅能够为肝细胞肝癌的早期诊断及检测提供新型的临床标志物,miRNA还可以作为判断肝细胞肝癌临床恶性表型及预后的工具。所以进一步深入研究在肝癌发生进展中起着重要作用的miRNA以及其深入的调控机制,能够为肝癌的精准治疗提供新的靶点和方向。近年来关于miRNA和肝癌进展的相关研究表明:miR-122是肝脏特异表达的miRNA,在正常肝脏表达丰富,miR-122在HCC组织低表达,可以靶向cyclin G1、Bcl-2等基因,有研究发现其可以促进丙型肝炎病毒(HCV)的复制。除此之外,大量研究也证实miR-101、miR-34a、miR-224、miR-222等在肝癌异常表达的miRNA在肝癌的发生发展过程中发挥了重要作用。以上这些结果提示miRNA在肝癌疾病进展中起到了重要的作用,micro RNA是HCC调控的重要环节之一。micro RNA能够参与肝癌细胞的分化、增殖以及凋亡等环节,对肝癌的发生和发展有着较为密切的关系,所以对于micro RNA与肝癌之间的关系也是目前诸多研究学者重点关注的问题。基于以上研究背景:本研究首先利用TCGA和GEO公共数据库的大样本肝癌表达谱数据分析发现肝癌组织中CCNB1表达水平呈异常升高,并且发现CCNB1的异常表达和肝癌临床恶性表型密切相关,并且CCNB1高表达是影响肝癌患者总体生存预后的独立危险因素,Kaplan-Meier分析结果显示CCNB1低表达的肝癌患者的生存时间明显好于CCNB1高表达的患者,提示CCNB1的表达和肝癌患者的临床预后密切相关。同时进一步的细胞功能试验证实:敲减CCNB1基因后肝癌细胞的增殖能力明显降低,迁移能力和侵袭能力以及成瘤能力明显降低,CCNB1基因敲减后肝癌细胞系的凋亡率明显升高,提示CCNB1在肝癌的发生发展中起到了重要的作用,但是其异常表达的机制尚不明确。为了研究CCNB1在肝癌中异常高表达的分子机制,我们首先通过生物信息学手段筛选鉴定出能够靶向抑制CCNB1的miR-144,并且我们通过RT-PCR、Westernblot证实在肝癌细胞中,miR-144能够靶向抑制CCNB1的表达。随后的分析我们发现miR-144的表达水平在肝癌组织中显著降低,miR-144低表达的肝癌患者的生存时间明显差于miR-144高表达的患者,提示miR-144的表达和肝癌患者的临床预后密切相关,miR-144可能是抑癌基因。并且我们在肝癌细胞中过表达miR-144后,肝癌细胞系的增殖能力明显下降,与CCNB1基因敲除有着相似的效果,提示miR-144/CCNB1调节轴在肝癌的发生和发展中可能起到了重要的作用。同时进一步,我们利用裸鼠皮下成瘤实验在体内进一步验证miR-144-CCNB1调节轴的体内作用,为miR-144-CCNB1调节轴成为肝癌潜在靶向治疗靶点提供更加充分的证据,我们首先构建miR-144过表达慢病毒载体,进一步采用祼鼠荷瘤实验观察miR-144过表达对肝癌细胞体内转移能力的影响。研究结果表明:和转染空病毒的裸鼠组相比,过表达miR-144后裸鼠皮下肝癌增殖速度明显减慢,裸鼠生存时间明显增加。同时经过免疫组化证实过表达miR-144后CCNB1表达降低,Ki67降低,说明肝癌中miR-144能够靶向负向调节CCNB1的表达,继而影响肿瘤增殖速度。通过以上三部分的实验,我们得出以下结论:1,CCNB1在肝癌中表达明显升高,并和患者转移、复发率等临床恶性表型和临床预后密切相关,CCNB1在肝癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用;2,miR-144在肝癌中能够特异性的结合CCNB1的3’UTR区,靶向调控CCNB1的表达。3,miR-144在肝癌中表达明显降低,同时miR-144低表达患者的生存时间明显短于miR-144的表达高的患者;过表达后,在体内外实验中,肝癌细胞系的增殖能力显著降低,迁移能力和侵袭能力以及成瘤能力明显降低,提示miR-144在肝癌的发生和发展过程中起到抑癌基因作用,miR-144通过负性调节其靶基因CCNB1的蛋白表达,从而促进肝癌进展。4,miR-144/CCNB1调节轴在肝癌的发生发展中起到了重要作用,有可能成为肝癌治疗的新靶点。第一部分CCNB1在肝癌中的表达和临床预后的分析及其在肝癌中的生物学功能目的:研究CCNB1在肝癌组织中的表达和临床特征及预后的关系,探讨CCNB1在肝癌增殖侵袭转移中的调节作用及其分子机制。方法:1.应用Western Blot方法检测8对肝癌和对应癌旁组织CCNB1蛋白在肝癌组织中的表达情况。2.基于生物信息学技术,利用基因芯片分析软件BRB-Arraytools进行肝癌基因表达谱挖掘,下载并分析TCGA和GEO公共数据库中的肝癌基因芯片数据,分析CCNB1 mRNA在肝癌组织与正常肝癌中的表达情况。3.利用TCGA公共数据库中的肝癌基因芯片数据,结合其临床随访数据,分析CCNB1 mRNA在肝癌组织中的表达和肝癌临床表型之间的关系。4.从mRNA和蛋白水平综合分析CCNB1表达强度与患者临床特征及预后之间的联系。5.基于组织芯片技术检测CCNB1蛋白在肝癌组织中的表达强度,通过单因素和多因素COX回归、以及生存分析等手段分析CCNB1蛋白表达强度与肝癌患者临床特征及预后之间的关系。6.利用RNA干扰技术沉默CCNB1基因,将靶向CCNB1的siRNA转染至肝癌细胞系HepG2和7721,检测研究其对肝癌细胞的生长(MTT)、凋亡(流式Annexin V染色法)、迁移(划痕实验)和侵袭(transwell)的生物学行为的影响。结果:1.肝癌组织中的表达:与正常肝组织对比,在mRNA(TCGA和GEO基因数据库分析)和水平蛋白(肝癌组织芯片),肝癌组织中CCNB1表达水平均有一定程度的上调(P﹤0.05)。2.根据CCNB1的表达水平,我们进行了单因素分析,从统计分析结果中我们可以看出,肝癌组织中CCNB1低表达占40%,高表达占60%,CCNB1的表达与TNM分期(P=0.038)、转移(P=0.000)、复发(P=0.030)有关,而与性别(P=0.573)、年龄(P=0.461)、肿瘤直径(P=0.057)、AFP(P=0.665)、HBs Ag(P=0.897)无明显相关。3.其次我们根据患者的预后进行了单因素分析,从统计分析结果中我们可以看出,肝癌患者的预后与TNM分期(P=0.006)、转移(P=0.000)、复发(P=0.041)以及CCNB1的表达有关(P=0.001),而与性别(P=0.430)、年龄(P=0.086)、肿瘤直径(P=0.118)、AFP(P=0.740)、HBs Ag(P=0.897)无明显相关。。4.根据肝癌组织芯片的分析结果我们发现,Kaplan-Meier分析结果显示CCNB1的表达水平与肝癌患者的预后密切相关,单因素分析结果显示CCNB1的表达与肝癌临床恶性表型(转移、复发、TNM分期及预后)密切相关。5.CCNB1基因敲减后肝癌细胞系的增殖能力明显降低,细胞迁移能力和侵袭能力以及成瘤能力受到显著的抑制;CCNB1基因敲减后肝癌细胞系的凋亡率明显升高。第二部分靶向CCNB1基因的miR144的筛选与鉴定及其对肝癌细胞生物学行为的影响目的:利用生物信息学技术对能够靶向CCNB1基因的micro RNA进行筛选和鉴定,并且在体外验证此micro RNA对肝癌生物学行为的影响方法:1.通过在线预测工具(Targetscan,miRwalk,miRanda)筛选出能够靶向CCNB1的miRNAs的集合,然后利用TCGA数据库中的425例肝癌样本的micro RNA表达谱进行分析,然后从中寻找出在肝癌和癌旁中表达存在显著性差异,且在肝癌中低表达的miRNAs,筛选出潜在的可能靶向CCNB1的miR-144。2.在肝癌细胞中过表达或抑制miR-144后,检测CCNB1 mRNA和蛋白表达水平变化。3.利用荧光素酶报告试验验证对miR-144对CCNB1的负性靶向调控作用。4.分析TCGA数据中micro RNA芯片表达谱数据,结合其随访数据,分析miR-144在肝癌组织中的表达和肝癌临床表型之间的关系。5.在肝癌细胞中过表达或抑制miR-144后,观察肝癌细胞的增殖能力变化。结果:1.生物信息学分析结果提示CCNB1可能是miR-144的靶基因。通过荧光素酶报告实验证实miR-144可以抑制含有CCNB1结合位点的萤光报告基因的活性。进一步的实验证实过表达或抑制miR-144对CCNB1表达水平有明显影响。2.miR-144的表达水平在肝癌组织中显著降低(p0.0001),并且Kaplan-Meier分析结果显示miR-144的表达水平和肝癌患者的临床预后显著相关(p=0.017),miR-144低表达的肝癌患者的生存时间明显差于于miR-144高表达的患者,提示miR-144的表达和肝癌患者的临床预后密切相关。3.miR-144过表达后,肝癌细胞系的增殖能力明显下降,与CCNB1敲除有相似的效果。从而证实了miR-144通过转录后水平负性调控CCNB1参与肝癌的侵袭和转移。第三部分miR-144对肝癌细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的:通过构建miR-144稳定过表达的肝癌细胞系,并皮下注射入裸鼠体内成瘤,观察miR-144对肝癌细胞生物学行为影响。方法:1.利用慢病毒技术构建过表达miR-144的肝癌7721细胞系。2.构建miR-144过表达慢病毒载体,将miR-144过表达载体感染肝癌细胞以上调miR-144表达,将这种过表达miR-144的肝癌细胞注入裸鼠皮下,在体内观察miR-144对肝癌生物学行为的影响。3.观察并记录裸鼠生存时间,记录肿瘤体积和重量变化,并绘制肿瘤生长曲线。结果:1.经RT-PCR和Westernblot鉴定,过表达miR-144的肝癌7721细胞系构建成功。2.体内实验证实,和转染空病毒的裸鼠组相比,过表达miR-144后肝癌增殖速度明显减慢,生存时间明显增加。3.免疫组化证实过表达miR-144后CCNB1表达降低,Ki67降低。全文结论1.CCNB1在肝癌中表达明显升高,并和患者转移、复发率等临床恶性表型密切相关,同时CCNB1低表达患者的生存时间明显高于CCNB1的表达高的患者;下调CCNB1后,肝癌的增殖能力显著下降,凋亡率明显升高,迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降提示CCNB1在肝癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用。2.过表达或抑制miR-144对CCNB1水平有明显影响,提示miR-144在肝癌中能够靶向调控CCNB1的表达。3.miR-144在肝癌中表达明显降低,同时miR-144低表达患者的生存时间明显短于miR-144的表达高的患者;过表达后,肝癌在体内外的增殖能力军显著下降,迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降。提示miR-144在肝癌的发生和发展过程中起到抑癌基因作用。4.miR-144通过负性调节其靶基因CCNB1的蛋白表达,从而促进肝癌进展,miR-144/CCNB1调节轴在肝癌的发生发展中起到了重要作用,有可能成为肝癌治疗的新靶点。


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