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西达本胺诱导NK/T细胞淋巴瘤细胞系凋亡的作用研究

靳梦园  
【摘要】:背景:NK/T细胞淋巴瘤(Natural Killer/T cell lymphoma)是EB病毒感染相关的非霍奇金淋巴瘤,常发生在亚洲和南美洲的部分地区且多为亚裔人群。它开始通常表现为上呼吸道感染、鼻炎、脓涕或涕中带血、中线肉芽肿,逐步侵入鼻腔、鼻咽、腭,使面部皮肤软组织破坏甚至发生远处转移。组织学上,肿瘤细胞表达NK细胞、T细胞抗原表型,如胞浆CD56、CD3ε、CD43、CD45RO、CD2等,同时表达细胞毒性相关蛋白如颗粒酶B、穿孔素、TIA-1。NK/T细胞淋巴瘤早期对放疗非常敏感,晚期预后差,以化疗为主或酌情加用放疗。常用的化疗方案有DDGP(顺铂、地塞米松、吉西他滨、培门冬酶)、改良SMILE方案(甲氨蝶呤、地塞米松、左旋门冬酰胺酶、依托泊苷、异环磷酰胺、美司钠、亚叶酸钙)等,但目前国际上还没有统一的治疗方案。肿瘤的发生发展过程不仅仅限于DNA层面的改变,也往往伴随着表观遗传修饰的紊乱。表观遗传学涉及的范围包括DNA甲基化(DNA methylation),基因组印记(genomicimprinting)、组蛋白乙酰化修饰等。目前研究的比较多的是DNA甲基化和组蛋白乙酰化,肿瘤细胞中甲基化或者乙酰化的异常可导致促癌基因的过表达和抑癌基因的沉默。近年来研究人员开发的DNA甲基化酶(DNA methyltransferase,DNMT)抑制剂和组蛋白去乙酰基酶抑制剂((histone deacetylases inhibitors,HDACIs)可以纠正这种异常。一些表观遗传学药物已经在包括乳腺癌、肺癌、宫颈癌、直肠癌及白血病等癌症临床试验和实际治疗中取得了成效。临床上,常规化疗药物因其毒副作用或者患者化疗耐药往往疗效不尽如人意。当前,使用表观遗传药物联合常规化疗药物则可以明显优于单独使用常规药物的效果。细胞中乙酰化水平的高低影响着基因的转录与相应行使生理功能的蛋白的表达。而组蛋白去乙酰化酶抑制剂能使肿瘤细胞的异常乙酰化状态得到纠正,改变染色质紧缩的结构,使得特定的基因转录,作用于多种信号通路,导致肿瘤细胞凋亡。随着多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的开发,研究者发现这种广谱的新型抗肿瘤药物可使肿瘤细胞周期阻滞、抗肿瘤血管生成、通过内外源两种细胞凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡,并且具有抗纤维化和化疗增敏的作用。西达本胺是我国自主研发的一种HDACI,已在国内被批准用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤,目前在多种临床试验中作为单一药物或与其他药物联合治疗各种血液和实体肿瘤的研究。吉西他滨(gemcitabine)能够影响DNA合成。作为一种周期特异性的临床常见的抗肿瘤药物,吉西他滨广泛应用于包括实体瘤、血液肿瘤在内的多种肿瘤治疗方案中,如晚期胰腺癌、非小细胞肺癌、转移性乳腺癌、膀胱癌、早期宫颈癌的新辅助治疗等。但在临床上,吉西他滨的疗效在部分患者中效果不佳,考虑肿瘤细胞对吉西他滨产生耐药,这就限制了吉西他滨的临床应用。因此,近年来将吉西他滨与其它化疗药物或者表观遗传学药物联合应用,取得了较好的临床疗效。如NK/T细胞淋巴瘤中,将吉西他滨与顺铂、地塞米松、培门冬酶共同应用,即DDGP方案较其它方案预后明显改善。吉西他滨联合奥沙利铂最近被推荐用于晚期胰腺癌一线治疗无效的患者中。NK/T细胞淋巴瘤恶性程度高,预后差,国际上还没有统一的治疗方案,表观遗传学药物如西达本胺能否在NK/T细胞淋巴瘤中发挥作用,目前研究的比较少。本篇论文将不同浓度的西达本胺作用于两种NK/T细胞淋巴瘤细胞系YTS、NKL,分别用CCK8法、流式及Western Blot检测西达本胺对两种细胞株的增殖、周期及凋亡、线粒体膜电位、信号通路等方面的影响,并在动物模型中进行了验证;此外,我们还将原有研究进一步拓展,验证DNA损伤剂吉西他滨与表观遗传学药物西达本胺联合应用的效果,采用CCK8法观察了不同浓度的两种药物互相作用下的协同效果,并根据结果选择了最适宜的浓度梯度进行后续研究,用同样的方法检测了两种药物联合后对周期、凋亡、线粒体膜电位、DNA损伤等方面影响,探究吉西他滨与西达本胺协同作用的机理,希望本研究能为淋巴瘤的临床治疗提供一种新思路。目的:探索西达本胺对NKTCL细胞株YTS及NKL的增殖抑制作用及其机制,研究吉西他滨联合西达本胺促进细胞凋亡作用效果。材料和方法:1.培养细胞:YTS细胞系的培养基为1640培养基与胎牛血清以9:1的比例混合,NKL细胞系培养基的配置与YTS略有不同,加入了1,000 U/ml的白细胞介素2(IL-2),根据细胞的状态调整换液时间及冻存时间,在恒温箱中37°C、5%二氧化碳的条件中培养。2.CCK8法检测细胞增殖:每种细胞系分为组,包括西达本胺单药组(0,10μM、20μM、40μM),吉西他滨单药组5n M、10n M、20n M,及两药联合组。每组设3个复孔,不同组间应严格排除混杂因素,接种到每孔的细胞数量均为16×104/ml,体积90ul。作用48h后,加入10ul的CCK8试剂,在酶标仪450nm波长处检测吸光度(OD值),再计算出肿瘤细胞的增殖抑制率并绘制出细胞增殖曲线,观察效果。两药联合组需要观察协同作用,在这里我们应用的是Calcu Syn软件(Biosoft,Cambridge,UK)计算协同指数CI(combination index),CI1,CI=1,和CI1分别代表在协同作用,相加作用和拮抗作用。CI值比1越小,协同作用越强。3.流式细胞仪检测凋亡和周期:将两种细胞系分为西达本胺西达本胺单药组(0,10μM、20μM、40μM),根据CCK8法绘制的细胞增殖曲线及CI指数确定检测两药联合作用的最适宜浓度,即小剂量西达本胺和小剂量吉西他滨联合,分为三组即(西达本胺10μM,吉西他滨10n M,两小剂量联合组)。依照凯基凋亡检测试剂盒及周期检测试剂盒的使用说明书处理各组细胞,依次上流式进行检测并后续分析。4.线粒体膜电位检测:细胞分组与流式细胞仪检测凋亡和周期该步骤的分组相同,用PBS清洗细胞后,用罗丹明染色,在培养基孵育半小时后洗去染料,荧光显微镜下观察,注意排除各组间的混杂因素,如细胞密度、处理手法等。5.Western Blot法检测周期、凋亡、调控线粒体膜电位及DNA损伤相关的蛋白:细胞分组方法同上,各组细胞处理48小时后收集清洗细胞,检测周期相关蛋白P21、CDK1,凋亡指标cleaved Caspase-3 Caspase-9,和cleaved PARP,调控线粒体膜电位相关蛋白bcl-2,DNA损伤标志γH2AX的表达情况,从基因表达水平进一步验证西达本胺及两药共同作用的途径机理。6.体内实验:建立小鼠模型,将荷瘤大小适宜的小鼠分为两组,生理盐水组与西达本胺组(10mg/Kg),观察瘤体在不同组之间的变化,并进行统计学分析。7.统计学分析:用spss21.0对实验数据进行分析,对于多组数据的分析采用单因素方差分析,P0.05表示有统计学意义。结果:1.西达本胺能使两种NK/T细胞淋巴瘤细胞系的组蛋白H3乙酰化水平上调,并且呈浓度依赖性;西达本胺能抑制YTS、NKL细胞系的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;吉西他滨与西达本胺共同作用于细胞系,抑制肿瘤增殖的作用明显增强,CI指数表明二者低剂量组联合应用时协同作用较高剂量组明显;在细胞形态方面,西达本胺单药组随着药物浓度的增加,细胞结构破坏逐渐明显。低浓度吉西他滨与低浓度西达本胺联合组较小剂量单药组细胞形态破坏更为明显。2.西达本胺能使YTS、NKL细胞系细胞周期阻滞在G1期,并伴有P21的上调及CDK1下调;两药联合主要阻滞在S期。3.西达本胺单药组随着药物剂量增加,细胞凋亡增加;类似的,两药联合组较单药组细胞凋亡程度更为明显。相应地,凋亡程度越明显的各组凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3 Caspase-9,和cleaved PARP表达增加。4.罗丹明染色后在荧光显微镜下观察,荧光强度与线粒体膜电位变化相关。西达本胺单药组随着剂量增加,线粒体膜电位变化增加,与之相关的蛋白bcl-2表达降低,DNA损伤标志γH2AX表达增加;联合组中这种变化更加显著。5.西达本胺通过阻断多种信号通路引起NK/T细胞淋巴瘤细胞系的凋亡,根据Western Blot结果显示这些信号通路包括JAK-STAT,PI3K/AKT和MAPK/RAS。6.与对照组相比,随着西达本胺的作用,小鼠瘤体的增长被抑制。剥离的瘤体可见西达本胺组的瘤体明显小于对照组。结论:1.西达本胺能抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞系的增殖。2.吉西他滨与西达本胺联合应用抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞系的增殖,且二者具有协同作用。


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