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手足口病患者的实验室指标和病原体分析及分子机制研究

朱杰辉  
【摘要】:目的1.调查2015年4月-7月在郑州市某儿童医院住院的手足口病患者的临床体征、实验室检查资料,并比较分析轻、重症患者实验室指标的差异,为临床检测患者的重症化提供依据。2.通过描述临床分离的EV71病毒的病原体分子特征,并分析比较轻、重症手足口病患者的EV71编码区特征的差异性,从病原体的角度探讨病原体引起手足口病重症化的原因。3.探讨EV71感染RD细胞后细胞内发生的氧化应激与细胞因子水平变化的关系。方法1.采用问卷调查对187例手足口病患者的一般情况和实验室指标进行收集,利用单因素及多因素分析轻、重症手足口病患者差异分布的实验室指标。2.从GenBank数据库收集经全基因组测序的EV71病毒共748株,通过文献检索最终筛选有明确临床特征的共230株。然后通过生物信息学软件进行230株EV71的分子特征分析,并进行差异位点的统计分析和二级结构及结构域的特点描述。3.通过检测比较EV71感染RD细胞0h、12h、24h、48h后的细胞内的活性氧水平来判断氧化应激的发生,然后通过Westernblot检测细胞内的磷酸化、未磷酸化NF-kappaB和IkBα的蛋白水平变化,ELISA检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α等炎性因子的表达。结果1.轻、重症手足口病患儿的中性细胞比率、淋巴细胞比率、IgM、降钙素原均随时间动态变化(P0.05);中性细胞比率(OR=1.198,P=0.001)、淋巴细胞比率(OR=1.194,P=0.002)、白细胞个数(OR=0.916,P=0.024)、血清钠离子(OR=0.690,P0.001)是手足口病患儿重症化结局的影响或预警实验室指标。2.共搜集到103株轻症和127株重症EV71型手足口病病人的病毒,以C4基因型为主,主要分布于亚太地区。分离于同一时间和地区的病毒之间的相似性较大,而分离于不同时间和地区的病毒相似性较小,遗传距离较远。轻症来源的EV71病毒之间的VP1氨基酸序列同源性为96%-100%,重症来源的病毒之间的VP1氨基酸序列同源性为94-100%,而轻症和重症来源的病毒之间同源性为92%-100%;轻、重症病毒有41个氨基酸差异位点分布有统计学差异(P0.05),P3蛋白区域变异最大,有26个氨基酸差异位点(P0.001);蛋白质二级结构及非二级结构分别有21和20个氨基酸差异位点的分布,结构域未见差异位点的分布。3.EV71感染RD细胞24h、48h后与0h相比,细胞内活性氧水平的变化有统计学差异(P0.05);而且48h后NF-kappaB被激活转运到细胞核内部的水平增加(P=0.0394).,与0h组即未感染空白对照组相比,感染12h、24h、48h后RD细胞中的IL-6细胞因子的水平均有明显升高,差异具有统计学意义(P0.05).;感染48h后RD细胞中的TNF-α的水平相比较感染0h组有一定的升高,差异具有统计学差异(P0.05).,而感染12h、24h组与感染0h组的TNF-α水平相比没有统计学差异。结论1.手足口病患者病程中免疫水平处于动态变化,且影响重症化结局。2.EV71病毒基因型分布具有时间和地区分布的差异;轻、重症病例来源病毒的相似性较低,通过氨基酸替换影响蛋白质的一级、二级结构可影响蛋白质功能的变化。3.EV71感染RD细胞可以诱导细胞产生氧化应激,并可激活NF-kappaB促进细胞因子IL-6、TNF-α的表达。


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