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miR-30a-3p/5p表达失调促进食管鳞状细胞癌发生和发展的作用及分子机制研究

齐博  
【摘要】:研究背景和目的:食管癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,其肿瘤相关死亡率位居所有肿瘤的第6位。食管癌的发生发展与人们的生活方式和饮食习惯密切相关,近年人们生活方式和饮食结构的转变在一定程度上增加了食管癌的发病率。食管鳞状细胞癌是食管癌最为常见的一种组织学分型,它在所有类型的食管癌中占绝大部分,且死亡率高。食管鳞状细胞癌在亚洲高发,在中国尤为高发。由于缺乏有效的早期诊断方法,大部分食管鳞状细胞癌患者初次诊断即处于癌症晚期,患者出现癌灶转移和复发的风险居高不下,5年生存率不足20%。食管鳞状细胞癌严重影响患者的生活质量和身心健康,死亡率高,复发转移率高,生存时间较短,同时给家庭和社会带来沉重的负担。因此,急需深入研究食管鳞状细胞癌发生发展的机制,寻找具有临床价值的分子标志物,为食管鳞状细胞癌的早期诊断和预后判断乃至有效治疗提供理论基础。食管鳞状细胞癌的发生发展涉及多方面的因素,包括不良饮食习惯、长期化学和物理刺激、人乳头瘤病毒感染和基因易感性等。为了探究食管鳞状细胞癌的个性化治疗方案,目前许多研究聚焦食管鳞状细胞癌患者的基因易感性。通过高通量测序技术对食管鳞状细胞癌基因组和外显子组进行测序分析。研究者发现食管鳞状细胞癌中存在多种变异,比如单核苷酸变异和基因拷贝数变异。其中,变异的基因广泛参与多种肿瘤相关信号通路,包括细胞周期调控、DNA损伤修复、RTK-Ras-MAPK-PI3K-AKT信号通路、Notch通路和WNT通路。值得注意的是,最近的研究表明,经典WNT信号通路和非经典WNT信号通路在食管鳞状细胞癌的发生发展中均发挥重要作用,有望将WNT信号通路中的关键基因作为食管鳞状细胞癌的预后和治疗的靶点。然而,食管鳞状细胞癌中WNT信号通路异常的调控机制有待进一步研究。微小RNA(microRNA)是一类非编码单链小分子RNA,含有18~22个核苷酸(nucleotide,nt),广泛存在于真核生物细胞中。microRNA不编码蛋白质,而是通过与靶基因的3’-UTR互补结合使其降解或阻碍翻译,从而影响靶基因的表达。通过不同的靶点,引起不同的作用。大量研究表明,已经发现microRNA参与调控体内多种细胞的分化、生长、增殖、代谢和凋亡等过程,其表达失调会引起多种疾病,包括肿瘤的发生发展。microRNA-30(miR-30)家族在进化过程中中高度保守,提示其在生物过程中具有重要作用。miR-30家族包含5个成员,miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e。miR-30家族在不同肿瘤中扮演不同的角色,例如,miR-30抑制非小细胞肺癌、乳腺癌和结直肠癌等,但可以促进神经胶质瘤、胃癌和胰腺癌。miR-30家族广泛参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移,以及上皮间质转化。miR-30家族的多面性可能基于不同的肿瘤环境下靶向作用于不同的促癌基因和抑癌基因,其确切机制仍需深入研究。越来越多的研究表明,miR-30a-3p/5p在多种肿瘤中发挥重要的作用。最近的研究揭示miR-30a-3p/5p通过WNT信号通路参与乳腺癌、神经胶质瘤和多发性骨髓瘤。本课题组在前期研究中通过网路数据库的分析发现miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中表达下调,生物信息学的分析提示miR-30a-3p/5p与WNT信号通路密切相关。然而,miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中的作用和调控机制尚未清楚。本课题拟通过实验进一步检测miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中的表达情况,分析其表达与临床病理参数之间的关系,并探究miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用和相关的分子机制。方法:1.利用公共数据库GEO database中的食管鳞状细胞癌基因芯片数据,分析miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌组织及配对癌旁正常组织中的表达情况;2.利用荧光实时定量PCR(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测食管鳞状细胞癌组织和配对癌旁正常组织中miR-30a-3p/5p的表达情况,并分析miR-30a-3p/5p的表达水平与食管鳞状细胞癌分化程度、TNM分期、总生存率等临床病理参数以及预后之间的关系;3.应用q RT-PCR检测正常食管鳞状上皮细胞和食管鳞状细胞癌细胞中miR-30a-3p/5p的表达水平;通过慢病毒包装系统建立miR-30a-3p/5p稳定过表达的食管鳞状细胞癌细胞株;利用瞬时转染技术,通过miR-30a-3p/5p inhibitor实现对食管鳞状细胞癌细胞内源性miR-30a-3p/5p的干扰;4.通过MTT、平板克隆形成和软琼脂克隆形成实验探究miR-30a-3p/5p在体外对食管鳞状细胞癌细胞增殖能力的作用;通过裸鼠皮下成瘤实验进一步确认miR-30a-3p/5p在体内对食管鳞状细胞癌细胞增殖能力的作用;5.利用公共数据库和miRWalk2.0分别分析miR-30a-3p和miR-30a-5p的靶基因,通过公共数据库KEGG对靶基因进行通路富集分析;6.通过双荧光素酶报告基因实验、免疫印迹实验和q RT-PCR实验验证miR-30a-3p/5p对WNT信号通路的调控作用,并筛选和验证miR-30a-3p/5p的靶基因。结果:1 miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌组织中的表达1.1公共数据库GEO database中miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中的表达情况GEO database中的食管鳞状细胞癌芯片GSE43732检测了119对食管鳞状细胞癌及其配对癌旁正常组织,其中miR-30a-3p和miR-30a-5p在食管鳞状细胞癌组织中的表达水平均显著低于配对癌旁正常组织(P0.05)。1.2食管鳞状细胞癌组织中miR-30a-3p/5p表达水平的检测使用qRT-PCR实验检测99对食管鳞状细胞癌组织(经术后病理证实)及其配对癌旁正常组织(经术后病理证实)中miR-30a-3p和miR-30a-5p的表达情况,结果显示81.82%(81/99)的食管鳞状细胞癌组织中miR-30a-3p/5p的表达水平显著低于配对癌旁正常组织(P0.05)。1.3食管鳞状细胞癌组织中miR-30a-3p/5p的表达水平与临床病理参数和预后之间的关系食管鳞状细胞癌组织中,miR-30a-3p/5p的表达水平在不同年龄组、不同性别和癌组织不同分化程度之间无显著性差异(P0.05);miR-30a-3p/5p的表达水平在肿瘤浸润深度(T)和淋巴结转移(N)不同程度分组中具有显著性差异(P0.05),并且二者之间呈负相关关系。使用Kaplan-Meier进行生存分析,并使用Log-Rank法进行总体生存率差异分析,结果表明miR-30a-3p/5p低表达组的生存率显著低于miR-30a-3p/5p高表达组,其差异具有统计学意义(P0.05)。2 miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌发生发展过程中的作用2.1食管鳞状细胞癌细胞中miR-30a-3p/5p过表达和干扰的实现qRT-PCR实验结果显示,miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌细胞株KYSE30和KYSE150中的表达水平低于正常食管鳞状上皮细胞株Het-1A;miR-30a-3p/5p在KYSE30中的表达略高于KYSE150。使用分子克隆技术成功构建miR-30a-3p/5p过表达的慢病毒表达载体,经测序鉴定插入序列正确、无突变。使用慢病毒载体系统构建miR-30a-3p/5p稳定过表达的食管鳞状细胞癌细胞株KYSE30-miR-30a-3p/5p;使用瞬时转染技术,通过miR-30a-3p/5p inhibitor对食管鳞状细胞癌细胞株KYSE150中miR-30a-3p/5p的内源性表达实现干扰。过表达和干扰效果均通过q RT-PCR实验进行了验证。2.2过表达和干扰miR-30a-3p/5p在体外对食管鳞状细胞癌增殖能力的影响MTT实验结果表明,miR-30a-3p/5p过表达的KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞生长速度明显慢于对照组KYSE30-control细胞(P0.05);而与对照组KYSE150-contorl细胞相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞生长速度显著加快(P0.05)。软琼脂克隆形成实验和平板克隆形成实验结果表明,miR-30a-3p/5p过表达的KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞形成克隆的数量明显少于对照组KYSE30-control细胞(P0.05);而与对照组KYSE150-control细胞相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞形成克隆的数量显著增多(P0.05)。2.3过表达和干扰miR-30a-3p/5p在体内对食管鳞状细胞癌增殖能力的影响裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组KYSE30-control相比,miR-30a-3p/5p过表达组KYSE30-miR-30a-3p/5p肿瘤生长速度较慢且肿瘤体积较小(P0.05);与对照组KYSE150-control相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p-inhibitor肿瘤生长速度较快且肿瘤体积较大(P0.05)。3 miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌进展过程中的作用机制3.1 miR-30a-3p/5p靶基因及其富集情况的分析使用网络数据库和算法miRWalk2.0分别预测miR-30a-3p和miR-30a-5p的靶基因,结果显示miR-30a-3p的靶基因有CCND2、PRKACB、MAPK10、WNT2、FZD10和DVL3,miR-30a-5p的靶基因有LRP6、FZD3、CSNK1A1、FZD2、MAP3K7和PRKCA。分别对两组靶基因进行KEGG通路富集分析,结果显示两组基因富集所在通路均有Pathways in cancer、Ras signaling pathway、MAPK signaling pathway和Wnt signaling pathway。3.2实验验证miR-30a-3p/5p对WNT信号通路的调控双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-30a-3p/5p过表达组KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞中WNT信号通路活性显著低于对照组KYSE30-control细胞(P0.05),而miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞中WNT信号通路活性显著高于对照组KYSE150-control细胞(P0.05)。q RT-PCR实验和免疫印迹实验表明,与对照组KYSE30-control细胞相比,miR-30a-3p/5p过表达组KYSE30-miR-30a-3p/5p细胞中WNT信号通路下游关键分子Cyclin D1的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显著下调(P0.05),而p27和p21的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显著上升(P0.05);与此相反,与对照组KYSE150-control细胞相比,miR-30a-3p/5p干扰组KYSE150-miR-30a-3p/5p inhibitor细胞中Cyclin D1的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显著上升(P0.05),而p27和p21的表达量在m RNA水平和蛋白质水平均显著下调(P0.05)。3.3 miR-30a-3p和miR-30a-5p分别直接靶向WNT信号通路的成员WNT2和FZD2qRT-PCR结果显示,使用miR-30a-3p minics过表达miR-30a-3p后,KYSE30细胞中WNT2的m RNA表达量显著下降(P0.05),而CCND2、PRKACB、MAPK10、FZD10和DVL3的m RNA表达量不受影响;使用miR-30a-5p minics过表达miR-30a-5p后,KYSE30细胞中FZD2的m RNA表达量明显下降(p0.05),但LRP6、FZD3、CSNK1A1、MAP3K7和PRKCA的m RAN表达量无明显变化。进一步的q RT-PCR实验和免疫印迹实验结果表明,过表达miR-30a-3p可以显著抑制WNT2在m RNA水平和蛋白质水平的表达(P0.05),而干扰miR-30a-3p可以显著增加WNT2在m RNA水平和蛋白质水平的表达(P0.05);同样,过表达miR-30a-5p能够显著抑制FZD2在m RNA水平和蛋白质水平的表达(P0.05),而干扰miR-30a-5p能够显著增加FZD2在m RNA水平和蛋白质水平的表达(P0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果表明,共转染miR-30a-3p过表达质粒plvthm-miR-30a-3p和包含野生型miR-30a-3p靶向序列的psi-check-WNT2-3’-UTR-WT质粒后,KYSE30细胞中荧光素酶活性显著低于共转染空载体plvthm和psi-check的对照组KYSE30细胞(P0.05),而共转染plvthm-miR-30a-3p和包含突变型miR-30a-3p靶向序列的psi-check-WNT2-3’-UTR-MUT质粒后,KYSE30细胞中荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);同样,共转染plvthm-miR-30a-5p和psi-check-FZD2-3’-UTR-WT后,KYSE30细胞中荧光素酶活性显著低于对照组(P0.05),而共转染plvthm-miR-30a-5p和psi-check-FZD2-3’-UTR-MUT后,KYSE30细胞中荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:1.食管鳞状细胞癌中miR-30a-3p/5p的表达水平显著下调;miR-30a-3p/5p的表达水平与食管鳞状细胞癌的分化程度、T分期和N分期以及患者总体生存率之间均呈负相关关系。2.过表达miR-30a-3p/5p可以抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖能力,而干扰miR-30a-3p/5p能够增强食管鳞状细胞癌细胞增殖能力。3.miR-30a-3p/5p在食管鳞状细胞癌中抑制WNT信号通路的活性,并且分别特异性地抑制WNT2和FZD2的表达。


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