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DNA甲基化对白血病ABO基因表达的影响

邵明  
【摘要】:目的ABO血型是人类最重要的血型系统,由正反定型二者决定的,正定型检测红细胞膜的ABO抗原,反定型检测血清中的抗体,正反定型同时检测,才能正确地进行ABO血型的定型检测。但在白血病和一些实体瘤患者进行ABO血型鉴定时,会出现ABO抗原改变导致正反定型不相符合的情况,极易引起血型误判,直接关系到临床输血安全。血液系统恶性肿瘤中ABO抗原改变最早是1957年由vanLoghem等人报道,出现该现象的原因并不清楚,可能的机制有杂合性丢失(lossofheterozygosity,LOH),基因突变和DNA甲基化导致基因沉默。目前研究发现,白血病患者ABO抗原减弱与DNA甲基化导致ABO基因沉默的关系更为密切。本研究通过检测白血病患者及正常对照者的ABO血型抗原强度、ABO基因启动子区CpG岛甲基化情况,对比白血病与正常人ABO基因启动子甲基化程度的差别,了解白血病患者抗原减弱的相关因素以及甲基化程度与ABO抗原减弱的关系;并培养白血病细胞株K562、HL-60和Jurkat,加入去甲基化药物地西他滨(Decitabine,DAC)后,检测DAC对三种白血病细胞株的生物学作用和去甲基化前后的ABO基因型、ABOmRNA与其启动子区CpG岛甲基化程度的变化,从体外水平探讨白血病ABO基因启动子区CpG岛甲基化对ABO基因表达的影响。方法1.对119例初治白血病患者及196例正常对照者进行ABO血型的检测,了解其ABO抗原表达的强弱。结合白血病患者的年龄、性别、实验室检查及白血病预后危险度分级等信息进行分析,归纳白血病ABO抗原减弱与各因素之间的关系;并应用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测白血病组与正常对照组ABO基因启动子区CpG岛甲基化状态,对比白血病与正常对照组ABO基因启动子甲基化程度的差别。2.培养白血病细胞株K562、HL-60和Jurkat,加入不同浓度的DAC,MTT法检测白血病细胞的增殖、流式细胞术检测白血病细胞的凋亡、Transwell小室基质胶侵袭试验及趋化试验观察侵袭情况,以找到DAC作用于三种白血病细胞株的最适作用浓度和时间。3.不同浓度的DAC作用于三种白血病细胞株,聚合酶链反应-序列特异性引物(Polymerase chain reaction sequence-specific primer,PCR-SSP)法检测白血病细胞株的ABO基因分型,实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)检测白血病细胞株ABOmRNA表达水平,亚硫酸氢盐测序法检测白血病细胞株ABO基因启动子甲基化水平。结果1.119例初治白血病患者中,A型33例,B型43例,O型39例,AB型4例,与健康对照组相比,二者血型分布无显著性差异,P0.05。白血病患者中有9例出现ABO抗原减弱,均为AML患者,健康对照组ABO血型均无抗原减弱现象。白血病ABO抗原减弱组与抗原表达正常组在ABO血型分布、年龄、肝脾淋巴结肿大、血小板计数、骨髓原幼细胞比例、免疫分型、LDH、危险度分层上无明显统计学差异,P0.05。抗原减弱组男性比例明显高于抗原正常组(77.8%30%),白细胞计数(32.26×109/L82.69×109/L)和血红蛋白平均含量(64.00g/L85.94g/L)明显低于抗原正常组,ABO基因启动子甲基化程度明显高于抗原正常组(18.91%10.76%),P0.05。急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)和急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)组ABO基因启动子平均甲基化率分别为52.68%和12.05%,均明显高于正常对照组(2.01%),P0.05;ALL组甲基化率明显高于AML组,P0.05。慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)慢性期患者的甲基化率为2.78%,和正常对照组无明显差异,P0.05,CML急淋变患者1例,甲基化率为92.56%,明显高于CML慢性期患者。2.终浓度为 0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L 的 DAC作用于白血病细胞株K562、HL-60和Jurkat 24h后,对各细胞株的增殖均有抑制作用,与对照组(Oμmol/L)相比均有显著性差异(p0.05),且随着药物浓度的增加和时间的延长,抑制作用逐渐增强,呈浓度、时间依赖性。终浓度为1μmol/L、10μmol/L的DAC处理三种细胞株72小时后,Annexin v FITC/PI双标记检测细胞凋亡率,三种细胞株实验组凋亡率均明显高于对照组,各细胞株不同浓度DAC组之间凋亡率有显著差异,P0.05。终浓度为1μmol/L、1Oμmol/L的DAC作用于三种细胞株24h后,可以明显抑制白血病细胞迁移、侵袭过膜的能力,P0.05。3.白血病细胞株K562、HL-60和Jurkat的ABO基因型分别为O1O1、O1A1和A1O2。K562细胞加药组与未加药组亮度改变不大;而HL-60、Jurkat细胞未加药组条带较暗,加药组两细胞株条带亮度明显增强。未加药组中ABO mRNA在K562细胞的表达水平明显高于HL-60和Jurkat细胞(分别为1275.67±35.86、0.54±0.007和0.82±0.16),P0.001,而HL-60和Jurkat细胞ABOmRNA水平无明显差异(P0.05)。加入不同浓度的DAC后,K562细胞的ABOmRNA含量无明显变化(P0.05),HL-60和Jurkat细胞的ABOmRNA表达明显增加(P0.05),与DAC浓度呈浓度依赖性。ABO基因启动子43个CpG岛中,未加药组K562细胞未发生甲基化;Jurkat细胞甲基化率达96.74%,HL-60细胞甲基化率为58.14%,加入DAC后,K562细胞ABO基因甲基化水平无变化,Jurkat和HL-60细胞的ABO基因启动子甲基化水平明显下降,与DAC浓度呈正相关(P0.05)。结论1.ABO抗原减弱患者以AML患者最多见,ABO血型抗原减弱患者ABO基因启动子甲基化程度明显高于ABO抗原正常患者,WBC、Hb水平明显低于ABO抗原正常患者。白血病患者ABO基因启动子区甲基化程度明显高于正常对照者,ALL甲基化水平高于AML。2.DAC明显抑制白血病细胞增殖、促进凋亡、抑制白血病细胞侵袭,并能明显降低白血病细胞株的ABO基因启动子区甲基化水平,增加ABOmRNA的表达。3.白血病细胞株K562、HL-60、Jurkat细胞表面均表达ABO血型抗原,且ABO基因启动子区甲基化水平与急性白血病ABO基因表达呈负相关,DNA甲基化导致ABO基因沉默是急性白血病ABO抗原表达减弱的重要机制之一。


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