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MiR-433通过下调PAK4的表达抑制A549细胞增殖及迁移

郑庆凯  
【摘要】:目的近些年来肺癌发生率日益严重,并且以非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)最为严重,已经有研究报道miR-433(微小RNA 433)与胃癌,口腔鳞状细胞癌有关。尚未发现miR-433对人非小细胞肺癌A549(人肺腺癌A549细胞株)的影响。因此,本研究着重探讨miR-433对人非小细胞肺癌A549细胞增殖及迁移的作用,从而为非小细胞肺癌提供诊断的科学依据。方法首先Real-time PCR(实时荧光定量PCR)法检测miR-433在A549、NCI-H1299(人非小细胞肺癌细胞株)、NCI-H358(人非小细胞肺癌细胞株)以及人肺成纤维细胞系HFL1中的表达。不同浓度miR-433 mimic(miR-433模拟物)转染A549细胞,选取最佳浓度进行后续分析;通过MTT法检测细胞增殖情况;采用Transwell小室检测细胞迁移情况;采用双荧光素酶报告基因法检测miR-433与PAK4(兔抗人P21活化激酶4)的靶向关系;利用Western blot法检测P21活化激酶4(PAK4)、LIMK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1)、p-LIMK1(磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1)、Cofilin(肌动蛋白结合蛋白)和p-Cofilin(磷酸化肌动蛋白结合蛋白)的表达。结果1.miR-433在三种NSCLC细胞中的表达显著下降,在A549组平均表达量为(0.42±0.047)其差异经过单因素方差分析有统计学意义(F=20.36,P0.003)。2.miR-433 mimic(80 nM)浓度组miR-433相对表达量142.02±10.25明显高于其他三组,经过单因素方差分析发现四组之间有统计学差异(F=26.32,P=0.004)提示过表达miR-433可显著抑制细胞增殖。3.为了了解过表达miR-433对A549细胞迁移的影响,随之进行Transwell试验,与空白对照组相比较,miR-433 mimic的一组图中显示A549细胞明显降低。miR-433 mimic可显著抑制A549细胞迁移(P=0.011)。4.在WT组中mimic对照组与miR-433 mimic组的荧光素酶活性分别为1.00±0.120、0.42±0.024,这提示miR-433 mimic可显著抑制荧光素酶活性(P=0.015)为了观察PAK4基因和蛋白表达与NSCLC细胞系的三种细胞之间关系,PAK4 protein在A549、NCI-H1299、NCI-H358三者中分别为3.25±0.21、3.35±0.39、3.38±0.15。从条带中也可看出A549、NCI-H1299、NCI-H358明显增粗,这都提示了PAK4基因可能是NSCLC细胞的靶基因。5.对于空白对照组、mimic control和mi R-433 mimic PAK4、p-LIMK1、LIMK1、p-coflilin、coflilin、GAPDH信号通路的影响分析以后发现,miR-433mimic转染可显著抑制PAK4、p-LIMK1以及p-coflilin的表达,条带明显稀疏、变细。结论1、miR-433在非小细胞肺癌细胞株中表达下调。2、过表达mi R-433可抑制A549细胞的增殖和迁移。3、miR-433通过靶向下调PAK4的表达,抑制LIMK1/cofilin信号通路,抑制A549细胞的增殖及迁移。4、miR-433作用机制的进一步研究对非小细胞肺癌的合理预防,科学诊断,判断预后提供新的研究方向。


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