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PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤的临床意义及其机制初步研究

路礼莎  
【摘要】:研究背景及目的:近年来,恶性淋巴瘤的发病率逐年上升,已经成为严重威胁人类健康和生命的主要肿瘤之一。NK/T细胞淋巴瘤(NK/T-cell lymphoma,NKTCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)的高度侵袭性的一种亚型,具有相应的临床表现特点,如病程快速进展,生存期短,预后不良等。国际上尚无标准的一线治疗NK/T细胞淋巴瘤的治疗方案。虽然已经在NK/T细胞淋巴瘤的治疗方面取得了进展,例如,使用培门冬酶和吉西他滨为基础的方案治疗晚期NK/T细胞淋巴瘤患者,总体反应率可达87.5%,化疗的副作用小,但许多患者由于多重耐药性(multiple drug resistance,MDR)而对药物具有耐药性,致使疗效不佳。目前,NK/T细胞淋巴瘤的分子发病机制已经多年研究探索,但仍不明确。研究表明,某些关键因子的异常表达和信号通路的异常激活参与多种病理类型的淋巴瘤的发生发展过程,因此进一步深入研究关键分子和信号传导通路、探讨NK/T细胞淋巴瘤的发病机制、寻找更有效的靶向治疗手段可作为提高NK/T细胞淋巴瘤化疗后的疗效和改善患者预后的一个潜在方向。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是从人的血小板中分离出的促血管生成因子。血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)是酪氨酸蛋白激酶家族成员,具有促进细胞趋化分裂增殖、细胞趋化、血管收缩及参与组织器官的生成分化等生物效应,它是决定肿瘤大小、转移、复发和预后的重要因素。PDGF/PDGFR通路作为促血管生成通路,与肿瘤的发生发展有密切关系,能促进肿瘤细胞的生长和迁移,加速周围基质的浸润并刺激血管再生。近年来,关于PDGF与肿瘤相关性的研究越来越多,提示PDGF参与多种肿瘤的发生、发展和转移等过程,并在这些过程中发挥重要作用。许多研究表明PDGFR的表达与多种癌症患者的临床预后相关,例如肝癌,卵巢癌和结直肠癌等。多项淋巴瘤的基因表达谱(gene expression profile,GEP)研究发现一些DNA表达失调的相关基因。所述基因中编码血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)基因多次出现过表达,并且相应的蛋白磷酸化发生改变,提示与患者临床预后相关。迄今为止,已有多项研究表明PDGFRα在淋巴瘤中的表达,但PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤中的研究尚少,其作用及其机制尚未见报道。PDGFRa在NK/T细胞淋巴瘤的表达和发生发展过程中的作用有待实验证明。前期,我们在NK/T细胞淋巴瘤细胞株转录组学的检测中发现,PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤细胞株中高表达。本研究的目的是研究PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤的发生发展和预后中的重要作用。因此,我们首先通过免疫组化、荧光定量PCR和Western blot实验方法检测PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织及细胞株中的表达,进一步分析PDGFRα的表达与NK/T细胞淋巴瘤各临床因素和预后的相关性,初步了解PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤中的表达情况;随后,通过PDGFRα特异性激动剂PDGF-AB和抑制剂Imatinib激活和阻断PDGFRα,运用CCK-8、流式细胞学等生物学方法分析PDGFRα对NK/T细胞淋巴瘤YTS、NKL细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,同时运用Western blot方法对相关机制作初步的探讨;此外,我们构建了两个NK/T细胞淋巴瘤裸鼠模型,YTS和NKL淋巴瘤裸鼠模型,通过Imatinib阻断PDGFRα,分析PDGFRα对NK/T细胞淋巴瘤小鼠模型肿瘤生长的影响,并同时对其相关机制作初步的探讨和验证。本研究结果将为确定PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤发生发展中的作用和识别NK/T细胞淋巴瘤靶向治疗的潜在策略方向提供重要的证据。第一章:PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤的表达及临床意义目的:通过免疫组化、荧光定量PCR和Western blot实验方法检测PDGFRα和p-PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织及细胞株中的表达,并进一步分析PDGFRα的表达与NK/T细胞淋巴瘤各临床因素和预后之间的相关性。材料与方法:1.收集78例NK/T细胞淋巴瘤患者组织和34例鼻咽部淋巴组织反应性增生组织蜡块,应用免疫组化方法检测PDGFRα和p-PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织和鼻咽反应性增生组织中的表达。2.采集78例患者各临床数据,Pearsonχ2检验用来检测PDGFRα与各临床资料之间的相关性。3.采用Kaplan–Meier生存曲线分析PDGFRα的表达与NK/T细胞淋巴瘤患者OS和PFS之间的相关性。Cox比例风险回归模型用于确定OS和PFS的预后因素。4.RT-PCR和Western blot方法检测NK/T细胞淋巴瘤细胞株(YTS和NKL)中PDGFRαmRNA和蛋白的表达水平。结果:1.在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织中,PDGFRα胞浆着色,70(89.7%)例患者表达阳性,且高表达组患者达42(53.8%)例。鼻咽部反应性增生患者25(73.5%)例PDGFRα表达阳性,与NK/T细胞淋巴瘤患者的表达差异有统计学意义(P=0.028)。77(98.7%)例NK/T细胞淋巴瘤肿瘤患者表达p-PDGFRα,4(11.8%)例鼻咽部反应性增生患者p-PDGFRα阳性表达,两组间p-PDGFRα的表达差异有统计学意义(P0.001)。2.PDGFRα高表达和PDGFRα低表达患者的性别,年龄,Ki67,β2-MG,EBV-DNA拷贝数和疗效无显着差异。两组患者在LDH水平和分期方面有明显差异,且差异具有统计学意义(P=0.028,P=0.013)。3.与PDGFRα低表达组NK/T细胞淋巴瘤患者相比,PDGFRα高表达组患者的PFS与OS明显缩短,且差异具有统计学意义(P=0.005,P=0.011)。COX模型多因素分析显示,III+IV分期(P=0.028)和PDGFRα高表达(P=0.048)是NK/T细胞淋巴瘤患者独立的预后不良因素。4.在mRNA水平,与正常NK细胞相比,PDGFRα在YTS(P=0.0002)和NKL(P=0.0004)细胞中表达均较高。同时,PDGFRα在YTS细胞的表达较NKL高,差异有统计学意义(P=0.0192)。在蛋白水平,与正常NK细胞相比,PDGFRα在YTS(P=0.0004)和NKL(P=0.0022)的表达也较高。同时,PDGFRα在YTS细胞比NKL的表达高,差异有统计学意义(P=0.0322)。结论:1.PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织中高表达且活化。2.PDGFRα的表达与性别、年龄、Ki67、β2-MG、EBV-DNA拷贝数及疗效均无相关性,且与LDH水平和分期相关。3.PDGFRα高表达是NK/T细胞淋巴瘤预后不良的独立因素。4.PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤细胞株(YTS和NKL)中高表达。第二章:PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤细胞株中的生物学作用及其作用机制的探讨目的:通过PDGFRα激动剂PDGF-AB和抑制剂Imatinib分别刺激和阻断PDGFRα信号通路,探索PDGFRα对NK/T细胞淋巴瘤YTS和NKL细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,并对其作用机制做初步探讨。材料与方法:1.CCK-8法检测PDGF-AB和Imatinib作用后YTS和NKL细胞的增殖能力的变化2.流式细胞术检测PDGF-AB和Imatinib作用后YTS和NKL细胞凋亡的变化情况3.流式细胞术检测PDGF-AB和Imatinib作用后YTS和NKL细胞周期的变化4.Western blotting方法检测Imatinib作用后YTS和NKL细胞中p-AKT、AKT、Erk和p-Erk等下游相关通路关键蛋白的表达水平变化。结果:1.PDGF-AB作用后,YTS细胞中,5 ug/L、25 ug/L、50 ug/L组与空白对照组相比,OD值增加,差异有显著性(p值分别为0.0114,0.0003,0.0001);在NKL细胞中,5 ug/L、25 ug/L、50 ug/L组与空白对照组相比,OD值增加,差异有显著性(p值分别为0.0166,0.0002,0.000)。在PDGF-AB处理浓度为5 ug/L、25 ug/L、50 ug/L时,两组之间YTS和NKL细胞增殖比较都具有显著性差异(P值分别为0.0165,0.0014,0.0045)。Imatinib浓度越高,YTS和NKL细胞生长速度越慢。随着时间的推移,YTS和NKL细胞生长越慢。10uM Imatinib作用48h后,YTS细胞的活性降低了65%,NKL细胞活性降低了49%,差异具有统计学意义(P=0.0389)。2.PDGF-AB作用后,YTS和NKL细胞凋亡比例无明显变化(P=0.2646,P=0.2045)。Imatinib作用后,YTS和NKL细胞凋亡比例增加(P=0.0002,P=0.0006)3.PDGF-AB作用后,YTS和NKL细胞S期细胞比例增加(P=0.0007,P=0.0027)而G0/G1期的比例明显降低(P=0.0000,P=0.0063);Imatinib作用后,YTS和NKL细胞G0/G1期细胞比例增加(P=0.0007,P=0.0027)而G2/M期的比例明显降低(P=0.0004,P=0.0001)。4.Western blotting结果显示,Imatinib的作用浓度越高,YTS和NKL细胞p-PDGFRα和p-Erk的表达越少,而PDGFRα、AKT、p-AKT和Erk等下游相关通路关键蛋白表达无变化。结论:1.PDGFRα激动剂PDGF-AB以浓度依赖性方式促进NK/T细胞淋巴瘤细胞株的增殖,且该促进作用对YTS较NKL显著。PDGFR拮抗剂Imatinib以浓度和时间依赖性方式抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞株的增殖。Imatinib抑制YTS细胞增殖的作用比抑制NKL的作用显著。2.PDGFRα激动剂PDGF-AB对NK/T细胞淋巴瘤细胞株的凋亡无影响,PDGFR拮抗剂Imatinib促进NK/T细胞淋巴瘤细胞株的凋亡。3.PDGF-AB可以促使细胞进入S期以促进细胞周期的进展。Imatinib可以将细胞阻滞在G0/G1期以阻止细胞周期的进展。4.PDGFR拮抗剂Imatinib通过抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞株Erk的磷酸化而发挥细胞生物学作用,并且其抑制作用呈浓度依赖性。第三章:PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤动物模型中的生物学作用及其作用机制的探讨目的:构建YTS和NKL淋巴瘤两种裸鼠模型,通过特异性抑制剂Imatinib阻断PDGFRα信号通路,探索PDGFRα对NK/T细胞淋巴瘤小鼠模型肿瘤的生长的影响及其作用机制。材料与方法:1.用BALB/c裸鼠构建YTS和NKL淋巴瘤动物模型。2.将构建成功的YTS和NKL荷瘤裸鼠分别分为两组,一组为Imatinib加药组,另一组为生理盐水对照组,按时给予药物处理。3.观察药物作用后,各组中裸鼠的生长情况及肿瘤体积的变化情况,测量并记录数据。4.药物处理24天后,处死各组裸鼠,测定小鼠体重和肿瘤体积,剥离肿瘤称重,计算肿瘤抑制率,记录实验结果。5.将新鲜肿瘤包埋在石蜡中,制成蜡块,切片,并进行病理性HE染色和相应指标的免疫组化。6.提取肿瘤的蛋白,通过Western blot方法检测各组裸鼠瘤体组织中p-AKT、AKT、Erk和p-Erk等下游相关通路关键蛋白的表达变化。结果:1.分别在第21和19天时,测量肿瘤组织平均体积达到100mm~3,YTS和NKL淋巴瘤动物模型制备成功。2.药物作用24天后,在YTS和NKL的两个裸鼠模型中,与空白对照组相比,Imatinib组瘤组织体积均明显减少(P=0.0002,P=0.0026),且Imatinib组肿瘤组织的平均肿瘤重量明显小于空白对照组(P=0.0001,P=0.0162)。Imatinib组小鼠的肿瘤生长速度明显慢于对照组。在YTS和NKL裸鼠模型中,Imatinib给药组抑瘤率分别为31.4%,21.4%。3.免疫组化提示NK、T细胞和细胞毒性颗粒相关标记CD3、CD56、Proferin和GrB在各组裸鼠瘤组织中呈不同程度的表达,并且在各组肿瘤组织中各个指标的表达无明显差别。在YTS和NKL裸鼠模型中,空白对照组与Imatinib组PDGFRα的表达无明显差异(P=0.505,P=0.906)。在YTS模型中,与空白对照组相比,Imatinib加药组中p-PDGFRα的表达有所降低(P=0.021);在NKL模型中,Imatinib加药组中p-PDGFRα的表达有所降低,但差异无统计学意义(P=0.053)。在YTS和NKL裸鼠模型中,空白对照组与Imatinib组中PDGFRα的表达降低,但差异均无统计学意义(P=0.079,P=0.170)。4.Western blotting结果显示,在YTS淋巴瘤裸鼠模型中,与空白对照组相比,Imatinib加药组肿瘤组织中p-PDGFRα(P=0.0052)和p-Erk(P=0.0076)低表达,而PDGFRα、p-AKT、AKT和Erk等下游相关通路关键蛋白表达无变化;在NKL淋巴瘤的裸鼠模型中,与空白对照组相比,Imatinib加药组肿瘤组织中p-PDGFRα(P=0.0067)和p-Erk(P=0.0310)低表达,而PDGFRα、p-AKT、AKT和Erk等下游相关通路关键蛋白表达无变化。结论:1.YTS和NKL淋巴瘤动物模型构建成功。2.PDGFR拮抗剂Imatinib能够抑制YTS和NKL淋巴瘤小鼠模型肿瘤的生长。3.通过免疫组化和Western blot结果发现,PDGFR拮抗剂Imatinib通过抑制MAPK/ERK信号通路的活化对YTS和NKL裸鼠模型发挥抗肿瘤的作用。全文小结1.PDGFRα在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织和细胞株中高表达。PDGFRα的高表达是NK/T细胞淋巴瘤患者预后不良的独立因素。2.PDGFRα激动剂PDGF-AB通过诱导细胞进入S期,促进NK/T细胞淋巴瘤细胞株的增殖。3.PDGFR拮抗剂Imatinib通过抑制Erk的磷酸化发挥其抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖,促进细胞凋亡和阻滞细胞周期进展的作用。4.PDGFRα拮抗剂Imatinib通过抑制MAPK/ERK通路活化发挥其抑制NK/T细胞淋巴瘤小鼠模型肿瘤的生长的抗肿瘤作用。


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