SA/Col/SDF-1水凝胶负载BMSCs对脑损伤大鼠的神经修复作用

【摘要】：创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是一种由外力引起脑部神经功能障碍的神经系统损伤性疾病,伴随认知、身体功能、心理等方面暂时性或永久性功能障碍。干细胞移植为TBI患者的治疗带来了新的希望,但干细胞在移植部位的流失和低存活率是干细胞治疗的主要障碍,组织工程技术对于提高干细胞的移植效果至关重要。可注射水凝胶(injectable hydrogel)具有高水含量和多孔结构等特点,并已广泛应用于组织工程领域。海藻酸钠(sodium alginate,SA)具有良好的生物相容性,是常见的药物载体。胶原(collagen,Col)可以促进外源干细胞在脑损伤部位的迁移和存活,提高干细胞治疗效果。SA与Col混合制备的水凝胶三维支架,可以减少细胞流失、改善干细胞的生存微环境,促进神经修复与功能重建。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)/及其受体CXCR4是干细胞活化、归巢和分化的关键因子,能调控间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的迁移。然而,正常间充质干细胞细胞膜上CXCR4的表达量很低,这就限制了体内MSCs靶向SDF-1的迁移能力。另一方面,损伤部位SDF-1表达升高,但TBI也可以激活金属蛋白酶2(metalloproteinase 2,MMP2)和金属蛋白酶9(metalloproteinase 9,MMP9)的表达,而MMP2和MMP9能够降解SDF-1导致神经退行性变,阻碍神经功能恢复。为了延长SDF-1半衰期或增加SDF-1的生物利用度,需要在损伤部位持续表达或分泌SDF-1。进一步研究表明,控制不同生物材料中SDF-1的释放可以刺激干细胞的归巢。但缓释SDF-1的SA/Col水凝胶支架对骨髓间质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在体内外的存活、迁移、分化及负载BMSCs对TBI的神经修复作用还未见报道。目的本课题拟以SA、Col为原料制备可注射型SA/Col水凝胶支架;以SDF-1的缓释为突破口,通过掺杂外源SDF-1,制备可缓释SDF-1的SA/Col/SDF-1神经支架,负载BMSCs,从细胞水平和动物模型上系统的研究BMSCs/SA/Col和BMSCs/SA/Col/SDF-1神经支架的细胞和生物相容性及支架移植的安全有效性。方法第一部分:SA/Col水凝胶的制备、优化及性能表征通过SA-CaCO_3-GDL体系制备SA、SA_4ColI_1复合水凝胶、SA_2ColI_1复合水凝胶;SEM观察凝胶内部微观形貌结构;试管倾斜法测定胶凝时间;冷冻干燥及称重法检测凝胶含水率和体外降解率;SA/Col水凝胶注射到SD大鼠的皮下,检测水凝胶在体内的降解率、HE染色检测移植部位的炎症情况,评价水凝胶的生物相容性;采用旋转流变仪、XRD(X-ray diffraction)等仪器表征水凝胶的弹性模量、化学成分等理化性质;CCK-8、AO-EB双荧光染色、激光共聚焦检测三种凝胶在1、3、5、7天内对BMSCs存活、增殖的影响。第二部分:SA/Col/SDF-1复合水凝胶的制备及其对BMSCs增殖、迁移的影响CCK-8检测0、100、150、200ng/mL SDF-1蛋白对BMSCs增殖的影响;Transwell检测SDF-1对BMSCs迁移的影响;免疫荧光、qRT-PCR检测150ng/mL SDF-1对BMSCs成神经分化的影响;ELISA检测SA/Col/SDF-1在1至30天缓释SDF-1的能力,Transwell检测缓释后SDF-1的活性;Transwell检测SA/Col/SDF-1水凝胶对BMSCs迁移的影响;CCK-8、AO-EB双荧光染色、激光共聚焦检测培养1、3、5、7天BMSCs在SA/Col/SDF-1水凝胶中的存活和增殖。第三部分:负载BMSCs的SA/Col/SDF-1水凝胶移植对TBI大鼠神经修复作用的研究采用改良Feeney自由落体打击法构建TBI大鼠模型,随机分为TBI组、BMSCs组、BMSCs/SA/Col组、BMSCs/SA/Col/SDF-1组(BMSCs均使用DiI荧光标记)。移植1、3、7、14、21、28天检测四组大鼠的体重变化、挂线时间变化、mNSS评分观察大鼠神经功能缺损情况;Morris水迷宫和新事物识别实验用以检测大鼠学习记忆、认知能力的恢复;糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验、新奇抑制喂养实验等评价四组大鼠焦虑抑郁情绪的差异;Western Blot实验用于检测移植后3天大鼠凋亡相关蛋白的表达;TUNEL染色用于检测移植后3天大鼠损伤处凋亡细胞数量;免疫荧光、ELISA实验检测大鼠炎症反应;CV染色检测移植后28天脑损伤体积的变化、干湿重法检测移植后3天脑水肿;利用DiI标记BMSCs检测移植后7、14天BMSCs/SA/Col组、BMSCs/SA/Col/SDF-1组中BMSCs在损伤部位存活、迁移差异;免疫荧光双标法、qRT-PCR检测神经营养因子变化;Western Blot实验SDF-1/CXCR4通路及FAK/PI3K/AKT相关通路蛋白的表达变化。结果第一部分:SA/Col水凝胶的制备、优化及性能表征1、SA-CaCO_3-GDL体系制备出的三种水凝胶呈半透明状,可根据模具塑形;SEM结果显示三种配比的SA/Col水凝胶内部均交替连接形成多孔网状结构。随着Col浓度的增加,孔径不断变小,成胶时间、含水率逐渐降低,体外降解率逐渐增加(P0.05)。水凝胶成分明确,弹性模量在200Pa至1000Pa,SA_2ColI_1与SA_4ColI_1、SA相比呈现出稳定的弹性模量特性。皮下SA/Col水凝胶具有良好的生物相容性,未发生炎症反应,体内降解速率与体外相一致。2、随着Col浓度的增加,BMSCs在SA/Col水凝胶中的增殖能力和存活率逐渐增加(P0.05)。综合比较各个性能,我们最终选择SA:Col为2:1的组分配比制备SA/Col水凝胶,用于后续实验。第二部分:SA/Col/SDF-1复合水凝胶的制备及其对BMSCs增殖、迁移的影响1、与NC组相比,100、150、200ng/mL的SDF-1均能促进BMSCs的存活与迁移,其中150ng/mL处理后对BMSCs的增殖、迁移和神经分化的促进作用更明显(P0.05)。2、SA/Col/SDF-1复合水凝胶能够持续稳定的释放SDF-1。其中第1天SDF-1释放量达到40%左右,随后进入缓慢释放过程,到第30天时,累计释放率达到93.5%。ELISA结果显示第3、12、21天释放的SDF-1能够明显促进BMSCs的迁移(P0.05)。150ng/mL SDF-1浓度的SA/Col/SDF-1水凝胶明显促进BMSCs的体外迁移(P0.05)。此外,BMSCs在SA/Col/SDF-1水凝胶中生长良好(P0.05),具有良好的生物相容性。第三部分:负载BMSCs的SA/Col/SDF-1水凝胶移植对TBI大鼠神经修复作用的研究1、自由落体打击法成功构建中度TBI模型;水凝胶原位移植10min后,病灶周围凝胶已明显形成;与TBI组、BMSCs组相比,随着治疗时间的延长,BMSCs/SA/Col组和BMSCs/SA/Col/SDF-1组大鼠体重明显增加,挂线时间延长、mNSS评分明显降低、学习记忆能力和认知功能明显得到改善、焦虑抑郁情绪明显缓解,且BMSCs/SA/Col/SDF-1效果更加显著(P0.05)。BMSCs/SA/Col以及BMSCs/SA/Col/SDF-1移植治疗能明显降低损伤部位细胞凋亡数目,减轻炎症反应,提高抗氧化水平,降低脑损伤体积,减轻脑水肿(P0.05)。2、BMSCs/SA/Col/SDF-1移植组中BMSCs在损伤部位的存活和迁移率明显升高,EdU/NeuN阳性细胞数和神经营养因子(BDNF,NGF)的表达明显增加(P0.05)。3、Western Blot结果显示,与其余各组相比,BMSCs/SA/Col/SDF-1组脑损伤侧SDF-1、CXCR4、p-FAK/FAK、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表达均显著提高(P0.05)。结论1、SA/Col可注射凝胶具有高含水率、稳定的降解能力和弹性模量,有利于BMSCs的增殖和存活。2、SDF-1能明显促进BMSCs存活和迁移,并显著增强BMSCs的成神经分化效率;SA/Col/SDF-1水凝胶能持续稳定的释放SDF-1并促进BMSCs的增殖和迁移。3、SA/Col/SDF-1水凝胶联合BMSCs移植显著改善TBI大鼠的神经功能、降低脑损伤体积、改善损伤部位微环境,促进BMSCs的迁移,促进TBI大鼠神经再生,其机制与SDF-1/CXCR4介导FAK/PI3K/AKT通路的活化有关。