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Let-7d在SiO_2诱导的肺泡上皮细胞间质转分化中的作用机制

于兴浩  
【摘要】:背景和目的矽肺是尘肺病中危害最严重的一类,也是职业病防治的重点和难点之一,关键在于其具体发病机制尚不清楚。目前认为,在矽肺发病过程中,肌成纤维细胞的大量增殖并分泌相关蛋白,是矽肺由炎症期不可逆转的进入纤维化期的关键环节。而肺泡上皮细胞的上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肌成纤维细胞的一个重要来源。以往研究提示microRNA let-7d和其靶基因高迁移率族蛋白A2(high mobility group AT-hook 2,HMGA2)共同参与了癌症和肾纤维化等疾病的EMT过程,是EMT过程的一个重要潜在干预靶点,但其在矽肺相关EMT过程中的作用尚未见报道。因此,本研究拟利用Transwell构建巨噬细胞和肺泡上皮细胞共培养模型,以SiO_2为受试物,体外模拟矽肺的EMT过程,观察let-7d以及HMGA2在该过程中的作用,然后采用脂质体转染等方法对let-7d以及HMGA2进行针对性干预,进一步探讨其相关机制,以期为EMT发生的机制研究提供新的思路。方法1.SiO_2诱导体外EMT模型建立及观察人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)和人单核细胞(THP-1细胞)常规培养。采用100ng/ml的丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。CCK-8实验确定SiO_2对THP-1诱导巨噬细胞染尘浓度,利用Transwell小室构建巨噬细胞和A549细胞的体外EMT共培养模型,实验分为空白对照组和SiO_2染毒组,采用qPCR和Western Blot方法检测SiO_2刺激前后上皮细胞标志物E-cad,间质标志物α-SMA和VIM的表达情况,同时检测let-7d和HMGA2表达情况。2.沉默HMGA2对SiO_2诱导体外EMT模型的影响采用siRNA转染的方法特异性沉默A549细胞中HMGA2的表达,qPCR方法选取沉默效率最佳的siRNA序列。实验分为阴性对照组、SiO_2染毒组、siR-HMGA2组和siR-HMGA2+SiO_2染毒组,qPCR和Western Blot方法检测SiO_2刺激前后E-cad、α-SMA、VIM以及HMGA2变化。3.干预let-7d表达对SiO_2诱导体外EMT模型的影响利用双荧光素酶报告基因实验验证HMGA2是let-7d靶基因。随后在SiO_2诱导的体外EMT共培养模型中转染let-7d mimics和let-7d inhibitor,干预A549细胞中let-7d的表达。实验分为阴性对照组、SiO_2染毒组、let-7d mimics/let-7d inhibitor组和let-7d mimics/let-7d inhibitor+SiO_2染毒组,qPCR和Western Blot方法检测SiO_2刺激前后E-cad、α-SMA、VIM以及HMGA2变化。4.统计学分析应用SPSS21.0对实验数据进行统计学分析。计量资料经正态性检验符合正态分布时,结果以均数±标准差(?X±S)表示。两组独立样本间的均数比较采用Student’s t检验。多组间均数差异的比较采用单因素方差分析进行比较,检验水准α=0.05。结果1.SiO_2诱导体外EMT模型的鉴定和检测情况CCK-8实验结果表明当SiO_2染毒浓度为150μg/ml时,细胞存活率接近50%。与对照组相比,SiO_2染毒组E-cad表达降低,α-SMA和VIM表达升高;同时,let-7d的表达降低,HMGA2的表达升高,差异具有统计学意义(P0.05)。2.沉默HMGA2基因后,EMT过程中相关指标的表达情况转染试剂与siR-NC均不会影响HMGA2的表达,转染siR1-3的A549细胞中HMGA2的mRNA表达均降低,其中siR-3沉默效率最高,差异具有统计学意义(P0.05)。siR-HMGA2组与阴性对照组、siR-HMGA2+SiO_2染毒组与SiO_2染毒组相比,E-cad表达升高,α-SMA和VIM表达降低,差异具有统计学意义(P0.05)。3.干预let-7d后,EMT过程中相关指标的表达情况双荧光素酶报告基因实验结果表明,转染HMGA2-3’UTR野生型载体的细胞中,let-7d mimics组荧光素酶活性水平与mimics NC组相比表达降低,报告荧光值分别为(82.08±0.61)%、(100.00±0.68)%,差异有统计学意义(P0.05);转染转染HMGA2-3’UTR突变型载体的细胞中,let-7d mimics组和mimics NC组报告荧光值分别为(95.11±0.51)%、(100.00±0.81)%,差异无统计学意义(P0.05)。转染let-7d mimics可以明显上调细胞内let-7d的表达水平。let-7d表达上调后,HMGA2表达降低。let-7d mimics组与阴性对照组、let-7d mimics+SiO_2染毒组与SiO_2染毒组相比,E-cad表达升高,α-SMA和VIM表达降低,差异具有统计学意义(P0.05)。转染let-7d inhibitor可以明显下调细胞内let-7d的表达水平。let-7d表达下调后,HMGA2表达升高。let-7d inhibitor组与阴性对照组、let-7d inhibitor+SiO_2染毒组与SiO_2染毒组相比,E-cad表达降低,α-SMA和VIM表达升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1.SiO_2可诱导A549细胞EMT过程,其中let-7d的表达降低,HMGA2的表达升高。2.通过干预let-7d、HMGA2的表达,可影响SiO_2诱导的A549细胞的EMT过程。


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