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食管鳞状细胞癌hsa_circRNA6448-14的功能及机制的初步研究

张耀文  
【摘要】:研究背景环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类新型的非编码RNA,在恶性肿瘤的进展中发挥重要作用。然而,circRNA在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的作用尚不清楚,因此我们构建我国高发区ESCC的circRNA表达谱,并探讨关键circRNA在ESCC中的功能及机制。第一部分 食管鳞状细胞癌相关circRNA表达谱分析目的构建我国高发区ESCC相关circRNA表达谱,筛选出差异表达circRNA并对其进行功能预测。方法选取6对ESCC组织和配对癌旁正常组织样本,采取基因芯片技术和微阵列分析构建circRNA表达谱;以差异倍数(FC)≥ 2倍且p0.05为条件,筛选差异表达的circRNA;通过GO和Pathway分析,预测circRNA的功能;构建circRNA-miRNA调控网络图,探讨circRNA作用机制。结果CircRNA在ESCC组织与匹配癌旁正常组织的表达差异明显,共发现15908个circRNAs表达失调(FC≥2.0,p值0.05),其中上调7161个,下调8747个。差异表达的circRNAs大多数分布在chr1、chr2、chr3和chr5,以1号染色体上最多。大多数差异表达的circRNAs是外显子来源,占比84.02%。GO和Pathway分析结果显示,差异表达的circRNAs主要参与细胞过程、代谢过程、生物调节、结合、催化活性等生物学功能,参与细胞外基质受体相互作用、粘着斑、蛋白质消化与吸收等多个调控通路。挑选FC最大的8个差异表达的circRNAs,共有 222 种 miRNAs 结合到这 8 种 circRNAs 上,构建 circRNA-miRNA网络调控图,能够更好地理解circRNA的相关机制,为探讨circRNA在ESCC中的生物学功能提供思路。结论成功构建ESCC相关circRNA表达谱,筛选出差异表达circRNA,绘制circRNA-miRNA网络调控图进行功能预测,揭示差异表达circRNA与ESCC存在密切联系。第二部分 Hsa_circRNA6448-14在食管鳞状细胞癌的诊断及临床意义目的验证初筛差异表达circRNA,找出关键circRNA,研究其在ESCC中的诊断价值及其临床意义。方法根据FC值、p值和信号值从差异表达circRNAs中随机选取7种circRNAs,筛选出5种差异表达circRNAs,进行qRT-PCR验证。qRT-PCR验证分两步进行:第一步,在26对ESCC组织及配对癌旁正常组织样本中对5种差异表达circRNAs进行验证,找出关键circRNA;第二步,另选取50对样本验证关键circRNA的表达差异。随访并记录ESCC患者术后的总生存期(Overall Survival,OS)和无病生存期(Disease-free Survival,DFS);使用卡方检验或确切概率法(Fisher检验)分析关键circRNA表达与ESCC临床病理特征的关系;生存预后采用Kaplan-Meier法并Log-rank检验行单因素分析,Cox回归模型行多因素分析;以p0.05为差异具有统计学意义。结果通过qRT-PCR验证26对ESCC组织及癌旁正常组织样本,找到关键circRNA hsa-circRNA6448-14,发现 hsa-circRNA6448-14 在 ESCC 组织中显著上调(p=0.0027)。然后在50对食管鳞癌患者样本中进行qRT-PCR验证,发现hsa_circRNA6448-14在ESCC组织中较癌旁正常组织表达显著上调(p=0.003),与芯片分析和第一步验证结果一致;ROC曲线下面积为0.906(95%CI:0.899~0.903,p=0.021),敏感度和特异度分别为 82.9%和 85.5%。Hsa_circRNA6448-14 表达与分化和 pTNM 分期(p=0.003、p=0.036)呈正相关。单因素及Cox多因素分析结果显示,pT分期和hsa_circRNA6448-14表达为ESCC术后DFS的独立预后因素(p=0.031、p=0.014),HR值分别为1.755(95%CI=1.054~2.921)、0.376(95%CI=0.173~0.819);食管癌家族史、pT分期和hsa_circRNA6448-14表达为ESCC术后OS的独立预后因素(p=0.033、p=0.007、p=0.003),HR 值分别为 2.149(95%CI=1.062~4.347)、2.516(95%CI=1.280~4.947)、0.199(95%CI=0.069~0.573)。Hsa_circRNA6448-14 高表达患者的 DFS 和 OS 较差,提示 hsa_circRNA6448-14高表达与ESCC的不良预后有关。结论Hsa_circRNA6448-14对ESCC的诊断和预后评估具有一定的临床价值,可作为ESCC潜在的生物学标志物。第三部分 Hsa_circRNA6448-14对食管鳞状细胞癌生物学行为的影响目的探讨hsa_circRNA6448-14对ESCC生物学行为的影响,深入了解hsa_circRNA6448-14 与 ESCC 的关系。方法建立hsa_circRNA6448-14敲低及过表达ESCC细胞模型,通过CCK-8实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,划痕实验检测细胞迁移,Transwell检测细胞迁移及侵袭,明确hsa_circRNA6448-14在ESCC中的生物学功能。结果Hsa_circRNA6448-14在4种ESCC细胞株中的表达显著高于食管正常上皮细胞(p0.05),hsa_circRNA6448-14 在 KYSE150 中表达水平最高,在 TE7中表达水平最低,因此选择这两种细胞株分别进行hsa_circRNAA6448-14敲低实验和过表达实验。敲低hsa_circRNA6448-14后KYSE150细胞增殖率降低,并且随着时间的延伸,尤以48h和72h最为显著;而过表达hsa_circRNA6448-14能显著增强TE7细胞的增殖能力(两者均p0.01)。敲低hsa_circRNA6448-14可以显著提高KYSE150细胞凋亡率,降低细胞迁移及侵袭能力;而过表达hsa_circRNA6448-14则明显降低TE7细胞凋亡率,提高细胞迁移及侵袭能力(均p0.01)。结论Hsa_circRNA6448-14能促进ESCC细胞增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡,在ESCC的发生发展中发挥促癌的正性调控作用。第四部分 Hsa_circRNA6448-14负性调控miR-455-3p在食管鳞状细胞癌中作用机制的初步研究目的探讨ESCC中hsa_circRNA6448-14对下游miRNA的作用机制。方法通过生物信息学方法预测hsa_circRNA6448-14的下游miRNA及其mRNA,绘制circRNA-miRNA-mRNA网络图,并行GO及Pathway富集分析。RNA pull down实验验证hsa_circRNA6448-14与miRNA的靶向结合位点。qRT-PCR检测ESCC组织中miR-455-3p的表达水平,并分析其与hsa_circRNA6448-14表达的相关性。结果预测hsa_circRNA6448-14可能的miRNA结合位点,依次为miR-503-5p、miR-455-3p、miR-4646-5p、miR-382-5p 和 miR-204-5p,绘 制hsa_circRNA6448-14-miRNA-mRNA 网络调控图。GO 及 Pathway 分析显示,hsa_circRNA6448-14可能参与细胞发生、发展、信号传导等生物学过程,参与结合,核结合转录因子的活性等分子功能,参与轴突导向、催化活性、粘着斑和肿瘤蛋白聚糖等通路的调控。RNA pull down实验表明hsa_circRNA6448-14可以与miR-455-3p靶向结合。MiR-455-3p在ESCC组织中表达水平低于匹配的癌旁正常组织,呈显著表达下调(p0.001),且hsa_circRNA6448-14表达和miR-455-3p 表达呈负相关(r=-0.701,p0.001)。结论Hsa_circRNA6448-14可以靶向结合miR-455-3p,可能通过负性调控miR-455-3p及其相关通路参与ESCC的发生发展。


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