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基于亲和纯化的无损伤式小细胞外囊泡分离方法的建立及应用

范琦琦  
【摘要】:小细胞外囊泡(Small extracellular vesicles,sEVs)是大多数细胞分泌的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡,在细胞与细胞之间的通讯中起着重要的作用。然而,由于其粒径小、丰度小和密度低,目前存在的提取小细胞外囊泡的方法都存在或多或少不同的缺陷,小细胞外囊泡的有效分离和无损释放仍然面临巨大挑战。针对目前小细胞外囊泡分离和纯化过程中存在的问题,我们设计了两种基于Annexin V的亲和磁珠,一种是使用FITC作为中间体,将Annexin V-FITC固定于抗FITC抗体磁珠上;另一种为直接将Annexin V偶联在羧基磁珠上。这两种磁珠分离和纯化小细胞外囊泡的原理相同,均为利用磁珠表面的Annexin V以钙离子依赖的方式与小细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸结合,从而富集磷酯酰丝氨酸阳性的小细胞外囊泡。经磁分离后,可去除小细胞外囊泡以外的其他杂质,更重要的是,通过添加含有金属离子螯合剂EDTA的洗脱液,磁珠富集的小细胞外囊泡可被无损伤释放和分离。将此方法应用于从胃癌细胞MGC-803的培养上清液中分离和纯化小细胞外囊泡,经过NTA,TEM以及Western blot检测,小细胞外囊泡的粒径,形态以及标志蛋白均符合标准。与经典方法超速离心法提取得到的小细胞外囊泡相比,两种方法提取得到的小细胞外囊泡的粒径大小基本一致,并且亲和磁珠法提取得到的小细胞外囊泡粒径分布更窄;在形态方面,亲和磁珠法提取得到的小细胞外囊泡能够更好的保持其完整的囊泡结构;在标志蛋白方面,亲和磁珠法更倾向于得到CD63阳性的小细胞外囊泡。此外,使用亲和磁珠法分离的小细胞外囊泡在细胞摄取测定和Transwell迁移测定中均保持了较高的生物活性。进一步验证发现,该方法适用范围广,可从血浆,唾液,尿液,牛乳,E.coli大肠杆菌培养上清液等多种生物样品中快速,高效的分离小细胞外囊泡。因此,这种高效的,无损伤的,经济的,广泛适用的小细胞外囊泡分离方法为研究其生物学功能提供了更方便的策略,为小细胞外囊泡的临床研究提供了更多选择。


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