喉鳞癌中FHIT基因纯合性缺失、甲基化、表达及其微卫星不稳定性研究

【摘要】： 喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的1％～8.4％。近年来，世界大多数地区喉癌的发病率及死亡率均有明显增高趋势，严重威胁着人类的健康与生命。多年来，尽管人们对喉癌的病因、病理、诊断和治疗等进行了深入的研究，但其发病机制仍不十分明确。同大多数恶性肿瘤一样，喉癌的发生是一个多因素、多步骤、复杂的渐进过程，其病程的发展和演进也同样涉及多个抑癌基因的失活和(或)癌基因的激活。研究表明，在喉癌中频发3号染色体短臂丢失，提示该区域可能存在与喉癌发生密切相关的抑癌基因。 1996年，Ohta等利用外显子捕获法从上皮癌细胞系3p14.2区域克隆出一个候选的抑癌基因，该基因包含染色体脆性部位FRA3B及家族性肾细胞癌相关的t(3;8)断裂位点，并含有编码组氨酸三联体的功能区，故命名为脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad，FHIT)基因。FHIT基因共有10个外显子，其中外显子5～9为编码外显子。研究表明FHIT蛋白是一典型的Ap3A(5’，5”-P1,P4-triphosphate)水解酶，能特异性水解Ap4A生成ADP和AMP。而Ap4A参与了DNA 不稳定性研究 的复制和细胞周期，FHIT功能丢失导致Ap4A在细胞内的堆积，最 终导致细胞恶性增殖及肿瘤形成。在裸鼠体内，向缺乏内源性FHrr 蛋白的癌细胞中导入野生型FHIT基因可抑制肿瘤的形成。在消化道 肿瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤等许多人类肿瘤中均发现高频FHIT 异常转录本。大多数研究表明，FHIT基因为一抑癌基因。 然而，FHIT基因与喉癌关系的研究报道较少，多集中在FHIT 基因一些微卫星位点的杂合性丢失(1055 of heterozygosity，LoH)分 析，且尚无明确定论。对于喉癌中FHIT基因结构的改变研究更为鲜 见，仅国内一位学者报道，且仅检测了喉癌中FHIT基因转录本的异 常。关于喉癌中FHIT基因纯合性缺失、甲基化这些重要的基因结构 改变和FHIT蛋白在喉癌中的表达情况以及它们与临床资料的相关性 分析，迄今国内外均未见文献报道。 为了深入探讨FHIT基因与喉癌发生发展的关系，本研究选取了 41例喉鳞癌及其相对应的喉正常粘膜，采用多种分子生物学技术进 行研究，将为阐明喉鳞癌发生的分子机制及FHIT基因在喉鳞癌发生、 发展中的作用提供理论依据。本研究分为以下两部分: 第一部分:喉鳞癌中FHIT基因纯合性缺失、甲基化、表达及其 l高床意义 方法: 1.采用外显子特异PCR(exon一speeifie PCR)扩增方法，检测41 例喉鳞癌及其相对应的喉正常粘膜中FHIT基因全部编码外显子的纯 合性缺失。 2.应用PCR一based酶切甲基化技术，研究了上述标本中FHIT基 因启动子区甲基化状态。 3.应用免疫组化SP法，检测上述标本中FHIT蛋白和PCNA (proliferating eell nuclear antigen，peNA)的表达。 郑州大学2003年博十论文喉鳞癌中FHIT纂因纯合性缺失、甲基化、表达及其微仪星不稳定性研究 4.同时探讨了上述改变与喉鳞癌临床病理特征的关系。 5.统计学分析:应用SPSS 10.0版统计软件包，采用xz检验、 FISher精确概率法、t检验及方差分析对所有资料进行统计学 处理。以P0.05作为差异有显著意义的检验标准。 结果: 1.喉正常粘膜组中，FH工T基因编码外显子ES~Eg均成 功扩增，无一例发生纯合性缺失，而对应的喉鳞癌组，ES一Eg 纯合性缺失率分别为26.8%(11/41)，14.6%(6/41)，9.8%(4/41)， 29.3%(12/41)和7.3%(3/41)。两组在各外显子中的纯合性缺失均 有极显著性差异(P0.01)。 2.ES、ES纯合性缺失均与肿瘤TNM分期和淋巴结转 移有关，ES纯合性缺失还随着肿瘤病理分级的增高而增高 (P0.05);ES、ES纯合性缺失有明显的相关性(P0.01); E6、E7、Eg纯合性缺失与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、 TNM分期、病理分级及淋巴结转移均无明显关系(P0.05)。 3.FHIT基因编码外显子总纯合性缺失率为 41.5%(17/41)。在TNM分期I一11期，总缺失率为26一%，显著 低于Hl一IV期的61.1%;而在无淋巴结转移组及有淋巴结转移 组，总缺失率分别为66.7%和26.9%。两组之间均具有统计 学意义(P0.05)o 4.喉正常粘膜组中，无一例出现 化，而在喉鳞癌组中，有24.4%(l 0/41) 显著性差异(P0.01)。 FHIT基因启动子区甲基 出现甲基化，两组之间有极 5.FHIT基因启动子区甲基化状态与喉鳞癌病理分级及 淋巴结转移有关(P0.01)，而与患者性别、年龄、肿瘤发 生部位及TNM分期均无明显关系(P0.05)。 郑州人学2003年博士论文喉鳞癌中FHIT幕因纯合性缺失、甲基化、表达及其微卫星不稳定性研究 6.喉正常粘膜组和喉鳞癌组，FHIT蛋白阳性率分别为 100.0%(41141)和46.3%(19/41)，两组之间有极显著性差异(P 0.01)。喉鳞癌中，在TNM分期I一11期和111一W期组，FHIT蛋 白阳性率分别为69.6%和16.7%;而淋巴结转移阳性组FHIT蛋白阳 性率为20.0%，显著低于无淋巴结转移组的61 .5%。两组之间均有显 著性差异(P0.05)。 7.喉正常粘膜组和喉鳞癌组中，PCNA标记指数分别为 9.98士2.34和50.71士13.64，两组之间有极显著