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河南食管癌高发区居民微卫星DNA杂合缺失和蛋白质组变化研究

安继业  
【摘要】: 食管癌(Esophageal Cancer,EC)是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,具有显著的地域性分布差异,5年生存率仅为10%左右,预后极差。河南省林州市及其毗邻的辉县、安阳等地区是我国,也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区;过去几十年,国内外科学家对该地区的长期研究提示:食管上皮癌变是一个多阶段演进和多基因变化(累积或叠加)综合作用的结果。食管癌高易感人群早期重要特征是食管基底细胞增生异常,形态学上表现为基底细胞过度增生(basal cell hyperplasia,BCH),间变(dysplasia,DYS)和原位癌(carcinoma in situ,CIS),这些病变被认为是食管癌前病变;食管癌前病变的显著生物学特征是其双向发展的不稳定性,即这些病变可维持多年不变,或向癌的方向发展,或退回到较轻的病变,那么,决定食管癌前病变不稳定发展的关键因素是什么?特别是形态学相似的癌前病变出现不同方向发展变化的机制是什么?导致轻度癌前病变持续向癌的方向发展的关键因素是什么?很显然,单纯从形态学的角度难以回答这些问题。我们的假设是:形态学相似的癌前病变可能具有不同的分子变化,这种分子变化可能是导致癌前病变不稳定性发展的关键因素。进一步阐明这种变化的特征和规律,不仅有助于了解食管癌变机制,而且具有重要的临床应用价值(早期诊断,高危人群筛选等)。 近年的研究提示:微卫星DNA的变异是细胞永生化和恶性转化过程中重要的标志之一,主要表现为微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)和微卫星的杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)。同一个体肿瘤组织与相应正常细胞中微卫星DNA长度存在一定的差异,表现为重复单元的增加或减少,这种差异被称为微卫星不稳定性(MSI);同一个体正常细胞DNA中存在两个等位基因,而其肿瘤组织DNA中一个等位基因消失,被称为微卫星的杂合性缺失(LOH)。微卫星DNA的变化可能是一个重要的肿瘤标志物,并已受到国内外学者的高度重视。 河南食管癌高发区居民微卫星DNA杂合缺失和蛋白质组变化研究 为进一步了解食管癌变多阶段演进过程中分子变化特征及其与形态学变化 的关系,我们采用多态微卫星标记,并选取染色体3p,sq,6p,gp,13q,16q,17和 18q的18个多态微卫星位点作为研究的重点(这些位点或与某个抑癌基因紧密连 锁或位于抑癌基因内含子区),对32例食管癌前病变和癌组织进行杂合缺失分 析。 nl.1 .1 .1材料和方法 nl.1 .1 .1 .1食管癌前病变组织和癌组织 32例原发性食管癌手术切除标本(男:18例,女:14例,患者年龄44一73 岁,中位年龄59岁)来自河南省食管癌高发区林州市人民医院,林州市中心医 院。所有病例术前未接受化疗和放疗。标本离体后,立即将标本沿中线纵行切 开,展平,一半用体积分数85%的酒精固定;另一半立即投入液氮保存,转运 到实验室后,再放入一80“C冰箱中。32例中有10例除了取癌组织外,还从癌旁 上皮(卜2处)取材,冰冻切片,片厚5 pm,收取 30一60张连续切片,每隔5张 取1张进行IIE染色,作组织学诊断,其余用于DNA提取进行杂合缺失分析。根 据细胞形态和组织结构,将食管上皮分为:正常上皮、基底细胞过度增生、间 变、原位癌和鳞状细胞癌(哪amous eell carcinoma,Sce)。 m.1 .1 .1 .2显微微切割分离所需食管上皮 根据HE染色的细胞定位,在待取玻片的相应部位滴上少许甘油(5%),用 sml注射器的针尖在解剖显微镜下分别刮取癌组织、癌旁上皮,置于180闭的裂 解液中,加20闭蛋白酶K,56oC振荡过夜。经此方法,可将各级癌前病变和癌组 织细胞纯化精确到90%以上。 nl.1 .1 .1 .3 DNA提取 按QIAGEN DNA肠ni瓦t的操作说明进行。 111.1 .1 .1 .4杂合缺失分析 111.1 .1 .1 .4.1选择微卫星DNA位点 根据本研究室以往对河南高发区居民食管癌变分子变化研究结果,围绕 p53一Rb系统,选择18个微卫星位点,进行LOH分析。这些位点及所代表的基 郑州大学博士学位论文2003届 因分别为:n35966和D3S1621(RASSFIA),D3S1234和D351300(F班T),D5582 (DPI),D55346(APC),D65497(HLA, Wafl),D9S1752(E冈K4A),DgS171 (刀吓K4B),D 135260(B RCAZ),D13S321和D135233(Rbl),D165265(E-ead), D17S513,TP53和D175786(P53),D175855(BRCAI),D185858(D CC)。 111.1 .1 .1 .4.2微卫星DNA多态分析 爷32P标记探针5’端,PcR扩增,8%聚丙烯酞胺凝胶电泳,放射自显影获 得LOH结果。 nl.1 .1 .1 .5结果判定 本组凝胶电泳结果分别由3位分子生物学专家参与分析,对食管癌、癌前 病变组织及配对癌旁正常上皮微卫星多态位点杂合缺失的结果进行判定。与正 常上皮对应的等位位点相比,若肿瘤组织中此多态位点的密度明显减低 (50%),即可推测这一位点存在基因或DNA片段的缺失。若结果判定不一致, 位点的密度用密度计量仪进行定量测定,与正常相对应的位点比较,密度减少 30%定为杂合缺失。结果分三类:①杂合缺失②杂合保留(无缺失)③无信息 (无多态改变)。 111.1 .1 1 .6统计分析 采用sPsslo.0统计软件处理,各组间率的比较采用才检验。


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