新生大鼠海马齿状回神经干细胞的鉴定、分化及GM-CSF mRNA的表达

【摘要】： 神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞能力的、能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。一般而言，神经干细胞至少具备3种特性：(1)缺乏神经系统分化的标志，如神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、波形纤维蛋白(Vimentin)。同时表达神经干细胞标志性蛋白-神经巢蛋白(nestin)；(2)自我更新能力；(3)多潜能性，即能分化成神经系统的各种细胞。神经干细胞的分离和培养为神经系统的神经性疾病的治疗提供了诱人的前景，利用细胞培养技术分离神经干细胞成为近年脑科学研究的热点之一。目前，人们已能从脐血、胚胎或成年动物的部分脑区(室下区、纹状体)分离培养出多潜能神经干细胞。但成年大鼠脑内神经干细胞数量有限，胚胎脑神经干细胞分离步骤繁琐。能否从新生大鼠海马齿状回分离、培养神经干细胞，国内外尚未见报道。 已有研究表明，某些细胞因子与神经干细胞增殖、分化有关，能影响神经干细胞分化的整个过程。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)广泛存在于造血系统、免疫系统和神经系统，能调节多种细胞的分化增殖。体外研究表明GM-CSF能明显提高神经元的存活率，降低凋亡率，但其对神经干细胞的作用及机制，现尚不清楚。 郑州人学L艺()(j3)研少〔’l毕刊l·L仑文 新沪}_友鼠海’今沐.状回神经卜细胞鉴走、分化及6翎比「砍、乃的农达 方法1本实验采用免疫组化技术观察出生Id的大鼠海马齿状回nostin表达。 采用神经球连续形成法从新生大鼠海马齿状回分离、培养神经干细胞，通过连续 传代培养观察其自我更新能力。采用神经干细胞nestin细胞免疫化学染色，鉴定 所分离的细胞是否为神经干细胞。 2采用MTT比色法测定细胞的光密度值(0D值)，每24h测定1次，从细胞接种到 神经球形成连续测定sd，绘制细胞增殖活性曲线。 3将BrdU加入传代后的单细胞悬液中，培养7d，收集新形成的神经球，行BrdU 细胞免疫化学检测。 4将传代培养的神经球离心收集，转移至24孔培养板，随机分为3组，每组24 孔细胞，置5%COZ、370C培养箱，连续培养7d，观察神经球的诱导分化。I组: DMEM压12(1:1)培养液的神经球，含10%小牛血清;11组:DMEM川12(1:1)培养液 的神经球，含10%小牛血清、100n留mlGM一CSF;111组:DMEM/F 12(1:1)培养液的 神经球，含100n乡mlGM一CSF。连续培养7d后，分别行NSE、GFAP细胞免疫化学 染色，对组间差异进行统计学处理。 5应用原位杂交技术观察神经一干细胞GM一CSF mRNA表达。 所有数据以均值士标准差(又，、)表示，并进行统计学处理。 结果l新生大鼠海马本部及齿状回均可见较多ne、tin阳性细胞。新生大鼠海马 齿状回分离的单个细胞通过传代培养，可形成神经球。 2 BrdU孵育5一了d后，新形成的神经球BrdU免疫标记阳性。连续测定0D值显示 培养第3d略有下降，之后，连续增高，8d后仍保持较高水平。 3细胞免疫化学染色发现，神经千细胞标记蛋白nestin在原代及传代神经球均有 表达，而NSE、GFAP在原代、传代神经球均未见表达。诱导分化7d后，完全分化 及未分化完全的细胞分别表达NSE、G队尸，而nesti。表达阴性。 4撤除有丝分裂原，I组和H组传代培养神经球可形成有l一2长突起神经元样细 郑州，学山()1、研宜’尸知{沱文 析‘}，、{谈.下:‘少l上二伏卜，}神经}红}{胞鉴上、分化及屯卜\1(’苏1了:，l权\八l勺衷达 胞或有多个粗长突起的星形胶质样细胞。细胞免疫化学方法，可分别显示出 NSE，GFAP免疫阳性细胞，l组内表达GFAP、NSE阳性细胞所占总细胞数的比例分 别为62.8%、1 3.5%;H组内表达GFAP、略E阳性细胞所占总细胞数的比例分别 为69.8%、25.9%;所有分化细胞nestin检测均为阴性。 5神经干细胞可表达GM一CSFmRNA，原位杂交阳性信号为胞浆着色，呈黄色或棕黄 色颗粒状，胞核内未见着色，且nestin染色阳性。PBS替代杂交液组的细胞未见 GM一CSFmRNA阳性信号。 结论l自新生大鼠海马齿状回能够分离、培养出神经干细胞。 2培养的神经干细胞具有连续增殖的能力。 3神经干细胞在一定条件下可分化为神经元和胶质细胞。 4神经干细胞可表达GM一CSF mRNA，与神经干细胞的分化调节有关。